新型生物農(nóng)藥白僵菌及其在果樹害蟲防治中的應(yīng)用

黃德發(fā) 鄭阿宗 黃國鴻 李群霞 高志偉

使用化學(xué)農(nóng)藥防治害蟲目前是確保農(nóng)業(yè)豐收的有效手段之一，但長期、大量及不合理使用化學(xué)農(nóng)藥帶來了環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品安全、破壞生態(tài)平衡等諸多問題。隨著環(huán)保要求的提高及可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的提出，相關(guān)研究者不斷在探索有效的綜合治理害蟲方法及可持續(xù)控制手段。生物農(nóng)藥具有環(huán)境友好，對(duì)高等動(dòng)物安全及不殺傷天敵等特點(diǎn)，逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。積極研究與利用生物殺蟲劑，尋求有效的生物防治手段，對(duì)保障生態(tài)平衡、農(nóng)副產(chǎn)品安全及可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。生物農(nóng)藥是替代高毒化學(xué)農(nóng)藥的選擇之一，是農(nóng)藥工業(yè)的發(fā)展方向之一。

1835年，意大利學(xué)者Agosino Bassi發(fā)表文章指出白僵菌是引起家蠶白僵病的病原微生物，并且能夠在家蠶之間相互傳染，由此奠定了昆蟲病理學(xué)的基礎(chǔ)。長期以來，白僵菌作為害蟲生物防治的重要手段而受到廣泛關(guān)注和深入研究，它是最早被用作殺蟲劑的蟲生真菌，也是國內(nèi)外研究最多、應(yīng)用最廣的蟲生真菌之一，是極其重要的昆蟲病原真菌。其寄主廣泛，十余個(gè)目，700多種昆蟲及蜱螨類。白僵菌具有寄主范圍廣、致病力強(qiáng)、持續(xù)控制中害、易工業(yè)化生產(chǎn)培養(yǎng)、對(duì)人畜及天敵安全、環(huán)境友好及目標(biāo)害蟲不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，長期以來被用作防治害蟲的重要手段。早在19世紀(jì)90年代，美國利用白僵菌防治麥長蜷。1938年美國人Lefebvre從我國東北引進(jìn)侵染玉米螟的白僵菌進(jìn)行室內(nèi)和田間試驗(yàn)，并取得了一些進(jìn)展。1938年，日本學(xué)者水戶武夫等就研究過利用白僵菌防治赤松毛蟲。20世紀(jì)70年代初期，法國就用布氏白僵菌成功地防治森林西方五月鰓金龜。前蘇聯(lián)也是研究及使用白僵菌防治害蟲的主要國家之一。我國20世紀(jì)50年代開始白僵菌研究和應(yīng)用，成功防治40余種害蟲。尤其成功應(yīng)用球孢白僵菌大面積防治玉米螟及松毛蟲取得了舉世矚目的經(jīng)濟(jì)效益及環(huán)境效益。

1 白僵菌的分類生物學(xué)特性

白僵菌是最常見的昆蟲病原真菌，在分類上屬半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，白僵菌屬。白僵菌屬寄主廣泛，先后有許多新種出現(xiàn)，目前得到承認(rèn)有8種，球孢白僵菌，布氏白僵菌、白色白僵菌、蠕孢白僵菌、粘孢白僵菌、多形白僵菌，蜘蛛白僵菌及蘇格蘭白僵菌。目前作為殺蟲劑使用的主要是球孢白僵菌及布氏白僵菌。白僵菌在蟲體上具有蔓延的白色菌絲，其菌落呈絨狀、叢卷毛至粉狀，菌落培養(yǎng)初期多呈白色，后期呈淡黃色，偶成淡紅色；有的很快形成粉層狀孢子，有的繼續(xù)保持絮狀。氣生菌絲透明，光滑、薄壁，疏松，有時(shí)成簇生長。產(chǎn)孢細(xì)胞常濃密簇生。但有時(shí)輪生或單生，直接著生在氣生菌絲、稍有分化的分生孢子?；蚺虼蟮呐菽疑?，瓶狀，下部膨大并延長成頸狀，在頂生的分生孢子下方不遠(yuǎn)處在分枝產(chǎn)孢，反復(fù)向頂部合軸式產(chǎn)孢，結(jié)果形成呈膝狀（“之”字形）彎曲的小齒狀產(chǎn)孢軸。產(chǎn)孢細(xì)胞核和孢囊常增生，在分生孢子梗及菌絲上聚成球狀到卵狀的相當(dāng)密實(shí)的孢子頭分生孢子單孢，透明，薄壁，無厚埂孢子。

白僵菌可通過分生孢子、芽生孢子、節(jié)孢子，內(nèi)生孢子和菌絲體的斷裂等多種方式進(jìn)行無性繁殖，其生活史類型屬多孢型。白僵菌生長發(fā)育與環(huán)境因素如溫度、濕度、光照、氧氣、氫離子濃度、營養(yǎng)物質(zhì)有很大關(guān)系。其中濕度對(duì)白僵菌孢子生長發(fā)育影響最大，白僵菌分生孢子的萌發(fā)和菌絲生長，均要求較高的空氣相對(duì)濕度。濕度在95%以上，分生孢子萌發(fā)迅速，濕度在95%以下孢子萌發(fā)所需要的時(shí)間要長得多，濕度90%以下則較難萌發(fā)。濕度還關(guān)系到白僵菌的傳播與流行。在溫度較高的環(huán)境條件下，孢子萌發(fā)長出芽管，穿透昆蟲體壁進(jìn)入血腔，白僵菌便利用寄主營養(yǎng)而生長繁殖，芽管伸長為菌絲，而后在血腔中以芽殖方式產(chǎn)生大量芽生孢子。在高濕條件下，菌絲自蟲尸表面長出，產(chǎn)生分生孢子，并借此開始新的感染。溫度則通常關(guān)系到孢子發(fā)芽和菌絲生長的速度及致病率的高低。分生孢子在5~30℃均能發(fā)芽，生長。分生孢子萌發(fā)和菌絲生長的適溫范圍為18~28℃，最適溫為25℃；35℃下短時(shí)間處理對(duì)孢子萌發(fā)和菌絲生長基本無影響，而在高于37℃條件下培養(yǎng)則一般不能萌發(fā)。溫度過低（15℃以下），孢子萌發(fā)率低，菌絲生長緩慢。

光照對(duì)白僵菌孢子的萌發(fā)、菌絲生長、孢子產(chǎn)生均有一定的影響，在黑暗條件下，孢子萌發(fā)時(shí)間縮短，菌絲生長速度緩慢，但菌落顯著增厚，該種菌落再經(jīng)過一段時(shí)間的光照就可以形成大量的孢子。在一定的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，孢子數(shù)量隨光的強(qiáng)度增加而增加。氧氣對(duì)分生孢子、菌絲生長均有促進(jìn)作用。白僵菌對(duì)酸堿度有廣泛的適應(yīng)性，白僵菌孢子在pH值3.0~9.4均能萌發(fā)，在pH值4.4的條件下，孢子萌發(fā)最快，且萌發(fā)率最高。在pH4.5~5.0的環(huán)境中，菌絲生長最旺盛，而形成分生孢子則以pH值6.0的環(huán)境為最好。

白僵菌對(duì)營養(yǎng)的要求，主要是碳源和氮源以及少量微量元素。碳水化合物作為其生長能源，碳作為生物合成的骨架，氮源是合成氨基酸、細(xì)胞蛋白及核酸物質(zhì)的重要元素。含淀粉和糖類等物質(zhì)的農(nóng)副產(chǎn)品，可提供碳源營養(yǎng)和能量來源。白僵菌對(duì)氮源的要求不甚嚴(yán)格，無機(jī)氮源如硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀及有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母膏、玉米漿、大豆餅粉等都能提供其生長和產(chǎn)孢所需的氮源，但無機(jī)氮源不及有機(jī)氮源好。礦物質(zhì)是白僵菌等蟲生真菌生長過程不可缺少的，其主要功能是用作細(xì)胞構(gòu)成的主要成分，作為酶的組成部分，并維持酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓、氫離子濃度及氧化還原電位等，一般所需的礦物質(zhì)包括硫、磷、鎂、鉀、鈉、鈣、鐵等。

白僵菌在培養(yǎng)基上可保持1~2年，干燥條件下甚至可以存活5年，蟲體上維持6個(gè)月，Marques等發(fā)現(xiàn)在相對(duì)濕度15.5%，溫度為-7℃的條件下白僵菌純孢粉在保存80個(gè)月后仍有活性。

2 白僵菌的殺蟲機(jī)制

2.1 侵染途徑及致病過程

白僵菌感染的途徑因昆蟲的種類、蟲態(tài)、環(huán)境條件等不同而有差別，主要通過表皮侵入昆蟲，也可通過消化管、氣孔、傷口等途徑侵入蟲體。白僵菌對(duì)寄主的侵染一般要經(jīng)歷10個(gè)階段，即：①分生孢子附著于寄主體表；②孢子在寄主體表萌發(fā)；③芽管穿透表皮進(jìn)入寄主體腔；④菌絲在寄主血腔內(nèi)生長；⑤產(chǎn)生有毒代謝物；⑥寄主死亡；⑦菌絲侵入寄主的所有器官；⑧菌絲穿出寄主體表；⑨在寄主體表重新形成孢子；⑩分生孢子擴(kuò)散。其中只要經(jīng)歷4~5個(gè)階段，就可以使昆蟲致病。

白僵菌的分生孢子接觸到目標(biāo)昆蟲后，由于分生孢子及寄主表皮共同的疏水作用，使得分生孢子吸附在附著在寄主的外表皮上。分生孢子被吸附后，可產(chǎn)生一些酶及分泌一些黏性物質(zhì)，使其進(jìn)一步固著在體壁上。目標(biāo)昆蟲的表皮成分不僅可以提供萌發(fā)生長時(shí)的營養(yǎng)，而且對(duì)形成的芽管有刺激作用。分生孢子萌發(fā)后，一般都形成長短各異、分枝或不分枝的芽管，所形成的芽管可依靠機(jī)械壓力直接穿透表皮，伸入體腔內(nèi)，在某些情況下，也會(huì)形成附著孢。在芽管穿透寄主體壁的過程中，同時(shí)分泌昆蟲表皮降解酶類，在這些酶的共同作用下，將蟲體局部體壁溶解，以利于菌體侵染。芽管在穿透表皮之后，在寄主血腔中產(chǎn)生菌體或延長形成菌絲后在產(chǎn)生一種酵母狀的蟲菌體，同時(shí)產(chǎn)生毒素，破壞寄主的防御系統(tǒng)，產(chǎn)生大量芽生孢子，芽生孢子也可直接生長成菌絲，菌絲不斷繁殖，侵入氣孔，充滿體腔，吸收營養(yǎng)，并會(huì)引起組織細(xì)胞的機(jī)械破壞，從而使寄主正常的代謝機(jī)能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終寄主因不能維持正常的生命活動(dòng)過程而死亡。

2.2 侵染過程中酶的作用

昆蟲表皮是一層結(jié)構(gòu)致密的防御屏障，主要成分分為幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)。雖然體壁結(jié)構(gòu)可以阻礙多種真菌入侵，而球孢白僵菌能有效地穿透昆蟲表皮，這引起學(xué)者們極大興趣。從被白僵菌侵染的昆蟲表皮上，發(fā)現(xiàn)和分離得到一系列昆蟲表皮降解酶，包括蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶及淀粉酶等。表面這些酶類在白僵菌入侵寄主時(shí)，尤其是在穿透寄主表皮過程中，起到重要作用。

用含有昆蟲幾丁質(zhì)合成的抑制劑的白僵菌孢子懸液處理煙草天蛾的幼蟲，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在協(xié)同作用。通過用不同的真菌對(duì)多種昆蟲幼蟲進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)白僵菌對(duì)一些昆蟲幼蟲的毒力與其胞外幾丁質(zhì)酶的活性有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在侵染昆蟲表皮時(shí)，白僵菌胞外蛋白酶往往最先產(chǎn)生，（<2小時(shí)），在3~5天后才檢測到幾丁質(zhì)酶活性，并且蛋白酶的產(chǎn)量明顯高于幾丁質(zhì)酶，這與昆蟲主要成分的結(jié)構(gòu)是一致的。昆蟲病原真菌侵入寄主昆蟲表皮時(shí)，先分泌蛋白酶降解昆蟲表皮中的蛋白質(zhì)，當(dāng)被蛋白質(zhì)包裹的幾丁質(zhì)暴露出來后才誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生，幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)時(shí)間很短，很快被表皮幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物所抑制，產(chǎn)量較低。因此，認(rèn)為白僵菌胞外蛋白酶是菌株主要的毒力因子。

2.3 侵染過程中產(chǎn)生的毒素

在白僵菌菌絲廣泛侵入器官和組織之前，病原菌就可以戰(zhàn)勝寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，因此可以推測是它產(chǎn)生的毒素起了作用。白僵菌能在昆蟲血腔內(nèi)產(chǎn)生10多種毒素，這些次生代謝產(chǎn)物可能作為免疫抑制因子限制細(xì)胞、寄主正常的防御反應(yīng)或直接作用于血細(xì)胞影響血細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，降低血細(xì)胞的吞噬和被囊作用。毒素主要有以下幾類：蛋白質(zhì)類，如從球孢白僵菌代謝物中分離得到10kDa毒素和TF-1,TF-2毒素。環(huán)肽類，如從球孢白僵菌中分離得到的白僵菌素，白僵菌素A及白僵菌素B。非肽類，如從布氏白僵菌中分離得到的卵孢霉素和布氏白僵菌素。從球孢白僵菌中分離得到的球孢白僵菌素，pyridovericin和pyridomacrolidin。

3 白僵菌的培養(yǎng)及生產(chǎn)

3.1 菌種的分離及改良

傳統(tǒng)的僵蟲法是目前白僵菌菌種主要的分離方法。此法易于獲得高毒力菌株，但尋找僵蟲的工作量大，且受季節(jié)限制。王濱等研究獲得快速分離純化球孢白僵菌的方法。史紅霞等研制了選擇性培養(yǎng)基因，可回收土壤中球孢白僵菌孢子達(dá)79.15%。

基因工程技術(shù)是提高菌株毒力的有效途徑之一。以現(xiàn)有優(yōu)良菌株為出發(fā)菌株，以已克隆和鑒定了的毒素基因（蝎毒基因）、毒力相關(guān)基因（降解昆蟲體壁的蛋白酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、酸性海藻糖酶基因等水解酶基因）、海藻糖合成關(guān)鍵酶6-硫酸海藻糖合成酶基因（tps1）為目的基因，構(gòu)建超表達(dá)多個(gè)毒素或毒力基因的多價(jià)工程菌株，使得Pr1蛋白得到超量表達(dá)，極大提高菌株的毒力。

3.2 發(fā)酵工藝

球孢白僵菌的生產(chǎn)主要有固體發(fā)酵、液體深層發(fā)酵及液固雙相發(fā)酵。生產(chǎn)的球孢白僵菌有3種形式的侵染體，就分生孢子、芽生孢子和菌絲。一般液體發(fā)酵生產(chǎn)芽生孢子和菌絲，但由于芽生孢子壁薄、在干燥過程中不穩(wěn)定等特性，其劑型和應(yīng)用受到限制。然而，在深層發(fā)酵中，無機(jī)氮源培養(yǎng)液產(chǎn)生的孢子也可是分生孢子。國外已開發(fā)出液體深層法生產(chǎn)白僵菌分生孢子的技術(shù)，而國內(nèi)陳昌潔等對(duì)多級(jí)深層發(fā)酵生產(chǎn)球孢白僵菌的方法也做了大量的工作。液固雙相發(fā)酵工藝是迄今所知?dú)馍稚咦幼畛墒斓纳a(chǎn)工藝。近年來國內(nèi)外對(duì)液固雙相工藝進(jìn)行了規(guī)范化研究，優(yōu)化工藝參數(shù)及發(fā)酵條件，確立了規(guī)范化生產(chǎn)工藝流程和配套機(jī)械，縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本。

液固雙相發(fā)酵過程包括液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩個(gè)階段，充分結(jié)合了兩者之長。這就是利用液體發(fā)酵快速生產(chǎn)大量的菌絲體或芽生孢子，再轉(zhuǎn)到固體營養(yǎng)或惰性基質(zhì)上使其產(chǎn)生最接近自然接種體形態(tài)的氣生分生孢子。該工藝克服了單純液相發(fā)酵生產(chǎn)的芽生孢子穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，最大限度地利用了固體表面上產(chǎn)生氣生分生孢子的優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于球孢白僵菌的大量生產(chǎn)。我國球孢白僵菌的雙相生產(chǎn)工藝和孢子粉分離提純技術(shù)已達(dá)到相當(dāng)高的水平。

3.3 制劑及使用方法

盡管殺蟲真菌的研究應(yīng)用歷史悠久，在相當(dāng)長的時(shí)期內(nèi)其制劑研制和應(yīng)用配套技術(shù)進(jìn)展緩慢，主要是殺蟲真菌的研究沒有引起社會(huì)足夠的重視。所以直到20世紀(jì)80年代前蘇聯(lián)制劑登記注冊。近年來，隨著人們環(huán)境意識(shí)的增強(qiáng)，殺蟲真菌的研制逐漸受到重視，每年登記注冊的殺蟲真菌產(chǎn)品不斷增加，目前，球孢白僵菌有20多個(gè)產(chǎn)品注冊，我國直到2003年才有第一個(gè)商品制劑登記注冊。

白僵菌為微生物活體殺蟲劑，在制劑加工及使用方法和化學(xué)農(nóng)藥有很大的不同。研究者不斷的擴(kuò)寬白僵菌作為殺蟲劑的應(yīng)用方法，制成不同的劑型，提高其應(yīng)用效果。白僵菌作為殺蟲劑生產(chǎn)初期主要?jiǎng)┬褪沁€有大量載體或培養(yǎng)料的原粉，運(yùn)輸不便且使用效果不穩(wěn)定。為解決運(yùn)輸及使用效果問題，首先研究者利用旋風(fēng)分離的方法，將孢子粉分離提純，得到含孢量很高的高孢粉。為了增強(qiáng)分生孢子對(duì)周圍環(huán)境的抵抗力，增加真菌殺蟲劑的存活力，人們將高孢粉進(jìn)一步與填料混合加工，制成各種劑型?？蓾裥苑蹌┦且枣咦臃奂尤霛駶檮┖洼d體混合而成的一種劑型；油懸劑是利用乳化劑將分生孢子制成油懸液的一種制劑形式；油劑是指將白僵菌孢子粉直接懸于植物油或礦物油介質(zhì)中而成的劑型，它是利用無紡布為培養(yǎng)基的載體，讓白僵菌在其生長，最終使害蟲感染其上的孢子而受到侵染，從而達(dá)到控制害蟲的目的，白僵菌制劑在使用過程中，根據(jù)不同的使用要求，結(jié)合具體的產(chǎn)品特點(diǎn)，主要采用噴霧法、噴粉法、飛機(jī)噴灑、超低容量噴霧法及撒施法等使用方法。

制劑標(biāo)準(zhǔn)化是生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定可靠的微生物殺蟲劑產(chǎn)品的一個(gè)重要保障。殺蟲真菌制劑的標(biāo)準(zhǔn)化一般包括強(qiáng)毒菌株的篩選、穩(wěn)定而可靠的劑型及標(biāo)準(zhǔn)檢測方法等一系列內(nèi)容。我國白僵菌制劑生產(chǎn)企業(yè)制定了油劑、純孢子粉劑、混合粉劑的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。然而白僵菌分生孢子制劑標(biāo)準(zhǔn)化和別的真菌殺蟲劑一樣也面臨多方面的問題，加強(qiáng)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)化研究十分必要。

4 白僵菌在果樹害蟲防治中的應(yīng)用

果樹害蟲包括地下害蟲蠐螬、金針蟲、螻蛄、蟋蟀、地老虎、白蟻、根蛆、擬步甲、線蟲等，它們生活在土壤中，危害果樹，對(duì)根部莖部危害嚴(yán)重；地上還有蚜蟲、粉虱、介殼蟲、綠葉蟬、青蟲、果食蠅、螨類等，主要危害葉片、花果及莖桿較為嚴(yán)重。

應(yīng)用白僵菌防治果樹害蟲，已取得顯著成效。據(jù)研究，在香蕉生長中期每公頃用卵子包白僵菌150萬億孢子或75萬孢子60千克，20天后觀察結(jié)果，防治蠐螨效果達(dá)95.7%；在果樹葉面噴施白僵菌防治蚜蟲、粉虱、青蟲等害蟲效果在90%以上。噴施白僵菌時(shí)結(jié)合生物光合酶“高利達(dá)”微量元素葉面肥混用，達(dá)到標(biāo)本兼治，效果更佳。

5 問題與討論

白僵菌是當(dāng)前國內(nèi)外害蟲生物防治研究、生產(chǎn)和應(yīng)用最多的殺蟲微生物之一。它是一種生產(chǎn)無公害綠色食品、無污染生態(tài)環(huán)境的最佳選擇之一。但白僵菌真菌殺蟲藥效慢，宜在幼齡害蟲發(fā)生時(shí)使用及前期預(yù)防為主。

（作者聯(lián)系電話：013850524137）