丹參注射液對細(xì)胞基底樣乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響

周瑞芳，劉鵬熙，劉曉雁

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院，廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

細(xì)胞基底樣乳腺癌(basal-like)生物學(xué)特性具有侵襲性，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差,不適合使用內(nèi)分泌治療,也無其他有效治療手段，是目前治療的難點之一[1]。因此，中醫(yī)藥干預(yù)在該亞型乳腺癌的綜合治療中就顯得尤為重要。本研究應(yīng)用中藥丹參注射液進行研究，觀察其對basal-like型的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響，期望能為basal-like型乳腺癌的治療提供新的契入點。

1 材料與方法

1.1 材料 basal-like型乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)；小牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液(PBS，廣州展晨生物科技有限公司)；青霉素、鏈霉素(廣州天心制藥廠)；噻唑藍(MTT，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；丹參注射液(批號:061123)江西桔都藥業(yè)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞采用開放式單層貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)液RPMI1640(10%小牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)，生長條件：37 ℃,5%CO2，相對飽和濕度。每天觀察生長情況，貼壁2～5 d傳代1次。實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 實驗分組 細(xì)胞對照組:不加任何處理因素，各處理組各濃度水平的共同對照。5個劑量丹參注射液組：2×10-1g/mL、2×10-2g/mL、2×10-3g/mL、2×10-4g/mL、2×10-5g/mL的丹參注射液。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞存活率觀察 MTT法測細(xì)胞增殖，收集對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×104/mL 接種于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,分別加入不同濃度梯度的丹參注射液繼續(xù)培養(yǎng)，之后每隔24 h，每孔加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL,繼續(xù)孵育4 h 終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 200 μL，使結(jié)晶物充分溶解。MTT比色法測定各孔光密度值，記錄結(jié)果。用下列公式計算藥物對細(xì)胞生長的抑制率:抑制率%=(對照孔測定的平均OD值-加藥組測定的平均OD值)/對照孔測定的平均OD值。

1.4.2 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率和細(xì)胞周期 各劑量組丹參注射液對MDA-MB-231細(xì)胞處理48 h，收集1×106個細(xì)胞，預(yù)冷的PBS液洗滌，1 300 rpm/min離心5 min,棄上清液，加入70%冷乙醇4 ℃固定并過夜，取固定好的細(xì)胞用4 ℃PBS洗2次,用500 μL/孔的碘化丙啶(PI)4 ℃避光染色30 min，上機前將細(xì)胞懸液混勻，過200目尼龍網(wǎng)，然后進行檢測,應(yīng)用CellQuest軟件獲取細(xì)胞10 000個，以ModiFit軟件進行凋亡峰擬合及細(xì)胞周期分析并繪制DNA分布圖，G1期前的G1亞峰(Ap峰)即為凋亡峰，同時計算出凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測增殖 對于basal-like型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，丹參注射液作用24 h，1×10-1g/mL的高濃度組促進MDA-MB-231細(xì)胞增殖(P<0.01)，促增殖率為27.2%；1×10-5g/mL低濃度組抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖(P<0.01)，抑制率為16.3%；在1×10-2g/mL、1×10-3g/mL、1×10-4g/mL濃度時對MDA-MB-231細(xì)胞增殖無影響。48 h，各劑量丹參注射液對MDA-MB-231細(xì)胞增殖均有抑制作用，抑制率分別為38.2%、29.9%、18.2%、15.6%、11.1%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。72 h，各劑量丹參注射液作用后其OD值均大于細(xì)胞對照組，促增殖率分別為46.%、37.6%、23.6%、45.6%、25.9%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示丹參注射液作用72 h能促進MDA-MB-231細(xì)胞增殖，見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測凋亡 丹參注射液作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h后,1×10-1g/mL、1×10-2g/mL、1×10-5g/mL的濃度下MDA-MB-231細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞群，凋亡率分別為20.5%、16.6%、12.2%，見表2。

表1 丹參注射液作用于MDA-MB-231細(xì)胞24、48、72 h的OD值(±s)

表2 丹參注射液作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h的凋亡率及細(xì)胞周期

2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 丹參注射液作用于basal-like型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48 h，1×10-3g/mL、1×10-4g/mL的濃度下MDA-MB-231細(xì)胞G2/M期DNA含量明顯增多，后者與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.6，P=0.022)。

3 討論

Basal-like型乳腺癌的免疫組化特征為ER、PR和HER-2陰性,常表達基底上皮指標(biāo)，并且侵襲性較強[2],這類患者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，除放化療并無其他特效的治療方法，因此尋找新的有效的治療方法尤其重要。丹參為唇形科多年生草本植物丹參的根及根莖，為活血化瘀類代表藥，脂溶性成分丹參酮、丹參醌藥理作用與植物性雌激素相似[3],研究中發(fā)現(xiàn)丹參有明確的促雌激素樣作用。丹參注射液是中藥丹參的靜脈制劑，主要含多種丹參酮，水溶性酚酸類成分,如丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B等是主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本實驗觀察了丹參注射液對basal-like型人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

丹參注射液作用于人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24 h，其作用隨著藥物劑量的下降，由促進增殖過渡為對增殖無影響再到抑制增殖，48 h、72 h分別表現(xiàn)出抑制增殖和促進增殖的相反作用。并且在實驗中1×10-3g/mL、1×10-4g/mL劑量組MDA-MB-231細(xì)胞G2/M期DNA含量明顯增多。人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞ER(-)，ER受體亞型ERɑ無表達，ERβ表達。PE通常在體內(nèi)E2水平較低時表現(xiàn)出類雌激素效應(yīng)。Wu Fei[4]發(fā)現(xiàn)外源性雌激素與E2的作用方式不同,他們的雌激素活性不需要激活ERɑ的AF-2區(qū)，對MDA-MB-231細(xì)胞的雌激素活性是結(jié)構(gòu)依賴性的。因此我們認(rèn)為丹參注射液促進MDA-MB-231細(xì)胞增殖、有絲分裂的作用與藥物劑量相關(guān)，有時間依賴性，并且其作用方式可能是獨立于ER的其他途徑。敬靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ?qū)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈時間一劑量一效應(yīng)關(guān)系。翁時秋等[6]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮作用于人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞72 h后，GEP100基因表達峰度顯著下調(diào)，在濃度達到1.0 μg/mL時下調(diào)尤為明顯，認(rèn)為丹參酮對于抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移有一定作用。張欣等[7]在體實驗結(jié)果提示丹參酮ⅡA能夠抑制接種MDA-MB-231細(xì)胞乳腺癌裸鼠腫瘤細(xì)胞的生長。以上研究與我們的實驗結(jié)果存在較大差異，究其原因，本實驗中使用丹參注射液，藥物原成分保存相對完整，成分多樣而復(fù)雜，需進一步的研究明了其各成分的真正效應(yīng)及作用途徑。

Chrzan BG[8]發(fā)現(xiàn)植物雌激素通過雌激素敏感元素報告基因激活ERβ1的轉(zhuǎn)錄，但他們的效應(yīng)較17-βE2弱400-600倍,對受體ERβ1的選擇性強于ERɑ。雌激素的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)受ERɑ和ERβ兩種受體共同調(diào)節(jié),但ERɑ促進增殖，ERβ抑制增殖[9]，且PE對ERβ有著更高的親和力[10]。本實驗中，丹參注射液抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，部分可能是通過ERβ發(fā)揮作用的。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定生理和病理條件下，遵循自身程序，由基因調(diào)控的主動性死亡過程。本實驗中，1×10-1g/mL、1×10-2g/mL、1×10-5g/mL的濃度丹參注射液作用后，Basal-like型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞P53基因變異,P53基因與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。劉永惠等[11]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮作用于接種MDA-MB-231S細(xì)胞的裸鼠后，經(jīng)蛋白酶聯(lián)免疫法檢測發(fā)現(xiàn)丹參酮能有效的抑制突變型P53和mdm2的表達。本實驗中丹參誘導(dǎo)了MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，可能是P53基因調(diào)節(jié)的。因此,我們認(rèn)為，丹參注射液對Basal-like型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響與時間點、藥物劑量相關(guān)。研究中某些劑量丹參注射液表現(xiàn)出促進MDA-MB-231細(xì)胞增殖、有絲分裂的作用與前人部分研究結(jié)果差異較大，考慮前人研究多選取單一丹參提取物，本研究中丹參注射液原藥成分保存較完整，成分復(fù)雜，作用靶點部位較多所致。本研究為體外實驗，中藥發(fā)揮作用的方式復(fù)雜，臨床中需要攝入體內(nèi)，通過胃腸道復(fù)雜的代謝轉(zhuǎn)化成有活性的產(chǎn)物而發(fā)揮作用。因此需進一步體內(nèi)實驗明確丹參的安全劑量及其作用的途徑與原理。

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