急性應激大鼠中樞色氨酸羥化酶-2表達變化☆

張盛宇* 禹順英* 汪東祥* 鄭賢杰胡淑楠李霞

·論 著·

急性應激大鼠中樞色氨酸羥化酶-2表達變化☆

張盛宇* 禹順英* 汪東祥* 鄭賢杰△胡淑楠△李霞

【摘要】目的 探討急性應激大鼠各腦區(qū)五羥色胺合成通路中色氨酸羥化酶-2（Tryptophan hydroxylase-2，TPH2）的作用機制。方法采用電擊誘導應激模型，將16只SD大鼠隨機分為實驗組與對照組，每組8只，實驗組每天上午予以40 min的電擊誘導1次持續(xù)3天，建模后采用曠場試驗評價大鼠行為；安樂處死，取血液及腦組織（海馬、前額葉、中縫核及紋狀體）低溫保存后采用采用實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）檢測外周血及各腦區(qū)的TPH2mRNA的表達。結果 經(jīng)3天電擊誘導后，實驗組大鼠活動明顯減少，與對照組行為學數(shù)據(jù)有顯著性差異（P＜0.05）。實驗組海馬（0.914±0.513 vs 3.640±2.836）、中縫核（0.484±0.374 vs 2.685±2.662）TPH2mRNA表達升高（P均 ＜0.05）；外周血、前額葉、紋狀體TPH2mRNA表達兩組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結論 急性應激大鼠在中樞海馬、中縫核TPH2mRNA的表達顯著增加，前額葉、紋狀體與外周血無顯著變化。

【關鍵詞】大鼠 急性應激模型 抑郁癥 色氨酸羥化酶-2

抑郁癥是一種常見的精神疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織、世界銀行和哈佛大學的一項聯(lián)合研究表明，到2020年單向抑郁癥將達到全球疾病負擔的第二位［1］。抑郁癥的病因學尚不明確，其中中樞五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）功能低下是抑郁癥生化機理中較公認的假說。色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）作為5-HT合成過程中的限速酶，調節(jié)5-HT的生成，是五羥色胺合成通路中非常重要的環(huán)節(jié)。TPH基因有TPH1和TPH2兩種亞型，研究發(fā)現(xiàn)TPH2基因僅特異地表達于中樞，腦干的TPH2mRNA水平約為TPH1mRNA的150倍，提示TPH2在中樞神經(jīng)5-HT的合成中起到重要作用［2］。中樞5-HT水平受很多因素的影響，包括合成、代謝和轉運等。抑郁癥中樞5-HT水平改變是否在合成環(huán)節(jié)中受到TPH2調控并沒有明確的定論。本研究運用逆轉錄聚合酶鏈反應，檢測急性應激模型大鼠大腦海馬、前額葉、紋狀體、中縫核及外周血TPH2的mRNA表達情況，探討TPH2在抑郁癥的病理機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由華東師范大學實驗動物科學部提供，封閉群屬，清潔級，SCXK（滬）2010-0002，6～8周齡，體重200～250 g／只。

1.1.2 主要試劑 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒（美國Fermenias公司），Real-Time PCR探針，Assays ID： Rn00598017＿m1（Taqman公司設計的探針）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組 聚碳酸酯飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，每籠3～4只，自由攝食進水，維持周期12 h的晝夜節(jié)律（光照時間7：00～19：00 h），飼養(yǎng)室溫度（22±1）℃，相對濕度50%，適應飼養(yǎng)環(huán)境1周后開始實驗。選擇16只大鼠隨機分為實驗組與對照組，每組8只。

1.2.2 動物模型的建立 建模方法電擊誘導抑郁模型［3］，實驗組大鼠每天按編號順序依次進行一次足部電擊，足部電擊電流為0.8 mA，間歇性電擊3～6 s電擊／2～8 s非電擊，電擊總時長40 min，持續(xù)三天；對照組正常飼養(yǎng)三天。予以曠場試驗檢測兩組大鼠行為學指標。

1.2.3 組織取材與樣品制備 行為學測試結束后將所有大鼠后處安樂死，取血樣與腦組織，用解剖鏡在冰面上分離雙側海馬、中縫核、前額葉、紋狀體，液氮凍存，以備逆轉錄聚合酶鏈反應檢測使用。

1.2.4 基因表達的檢測 將凍存腦組織勻漿儀勻漿，血液離心后取粒細胞，加入800 μL Trizol保存，并轉移至1.5 mL EP管中，充分混勻，室溫靜置15 min。采用Trizol法提取RNA，然后用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應將mRNA逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）檢測外周血及各腦區(qū)的TPH2mRNA的表達。反應程序為：①預變性：50℃孵化 2 min，95℃預變性 10 min；②PCR反應：95℃變性15 s，58℃退火1 min，40個循環(huán)；③溶解曲線生成：95℃預變性1 min，55℃退火1 min，55℃退火10 s并以每循環(huán)增加0.5℃的溫度進行80個循環(huán)。使用Sequence Detector Software（SDS） version 2.1軟件 （Applied Biosystems，CA，USA）實時收集熒光信號，然后應用比較Ct值（Comparative Ct Values，△Ct）方法計算TPH2基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）來描述。對所獲數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)性數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用獨立樣本秩和檢驗。對相關分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Pearson相關分析，偏態(tài)數(shù)據(jù)采用Spearman相關分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結果

2.1 實驗組與對照組大鼠行為學比較 大鼠曠場試驗各行為學數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布（P＞0.05）；經(jīng)3 d電擊誘導后，實驗組大鼠活動明顯減少，與對照組比較，經(jīng)t檢驗，總移動距離 （t＝3.043，P＝0.009）、總移動時間（t＝3.308，P＝0.005）、頭動總距離（t＝3.930，P＝0.002）、總越限次數(shù)（t＝2.761，P＝0.015）與總轉身次數(shù)（t＝2.504，P＝0.025）差異均有統(tǒng)計學意義。詳見表1。

2.2 實驗組與對照組大鼠外周與中樞TPH2mRNA表達比較 TPH2mRNA在外周血、海馬、中縫核、前額葉與紋狀體中均有表達，且均可被檢測，詳見圖1。TPH2mRNA在外周血、海馬、中縫核、前額葉與紋狀體中表達檢測值均呈非正態(tài)分布（P＜0.05）。與對照組比較，經(jīng)Mann-Whilney U檢驗，實驗組海馬（Z＝－2.100，P＝0.036）、中縫核TPH2mRNA表達（Z＝－1.995，P＝0.046）上升有統(tǒng)計學意義。前額葉（Z＝－1.279，P＝0.201）、紋狀體（Z＝－0.525，P＝0.600）及外周血（Z＝－1.314，P＝0.195）與對照駔相比差異無統(tǒng)計學意義。詳見表2。

2.3 實驗組大鼠行為學指標與中樞TPH2mRNA表達相關性分析 實驗組大鼠在移動總時間、移動總里程、總越限次數(shù)、頭動總距離、總轉身次數(shù)的行為學數(shù)據(jù)與外周血及大腦各區(qū)TPH2mRNA表達均無相關（相關系數(shù)r范圍－0.491到0.368，均P＞0.05）。

表1 電擊誘導后實驗組與對照組大鼠行為學比較（±s）

表1 電擊誘導后實驗組與對照組大鼠行為學比較（±s）

1）與對照組相比，經(jīng)t檢驗，P＜0.052）與對照組相比，經(jīng)t檢驗，P＜0.01

曠場試驗行為學指標組別實驗組對照組總移動距離（m）6.237±4.2342）12.792±4.381總移動時間 （s）87.738±53.1082）183.675±62.516總越線次數(shù)732.625±194.2611）1101.250±323.863頭動總距離（m）18.296±8.3972）36.009±9.591總轉身次數(shù)9.375±3.8151）16.000±6.436

表2 電擊誘導后對照組與實驗組大鼠TPH2 mRNA表達比較（±s）

表2 電擊誘導后對照組與實驗組大鼠TPH2 mRNA表達比較（±s）

1）與對照組相比，經(jīng)Mann-whilney U檢驗，P＜0.05

TPH2mRNA表達組別實驗組對照組外周血0.508±0.510 1.043±0.787海馬3.640±2.8361）0.914±0.513中縫核2.685±2.6621）0.484±0.374前額葉1.930±1.741 1.199±1.588紋狀體1.123±0.743 1.465±0.904

圖1 大鼠TPH2mRNA值在組織中的表達經(jīng)PCR擴增顯示穩(wěn)定可靠

3 討論

抑郁癥被認為一種應激相關性疾病，研究發(fā)現(xiàn)單次和重復應激都能增加海馬5-HT的釋放和代謝［4］。本研究使用連續(xù)3 d天電擊作為應激方式，建立急性應激模型。其理論基礎為，讓動物在短時間內處于不可逃避的應激刺激，并感知到這種刺激的無法控制時，便會出現(xiàn)類似人類的絕望、無力、悲觀等行為學特征［5］。在經(jīng)過3 d電擊刺激后，實驗組大鼠活動明顯減少，與對照組相比各項曠場試驗行為學數(shù)據(jù)都有顯著性差異，出現(xiàn)了“類抑郁行為”。

中樞水平5-HT合成基本上依賴TPH2的水平。TPH2的水平取決于其合成過程中基因的轉錄，蛋白的翻譯，以及酶的活性等方面。在對于各個腦區(qū)TPH2mRNA表達的檢測中發(fā)現(xiàn)，實驗組TPH2mRNA表達在海馬、中縫核較對照組有所增加，反應了在連續(xù)3 d的電擊誘導后，TPH2基因轉錄水平增強。國外也有文獻報道在行為絕望抑郁模型大鼠（即強迫游泳試驗）刺激后24 h大鼠中樞檢測中發(fā)現(xiàn)，大鼠下丘腦和杏仁核的5-HT和其代謝產(chǎn)物五羥色胺酸濃度顯著下降，中縫核TPH2mRNA水平上升［6］。推測TPH2mRNA表達的上升是急性應激狀態(tài)下中樞五羥色胺下降后的代償?shù)姆磻?。由此可以進一步推測，急性應激后5-HT水平的下降可能并不是由TPH2調控的合成通路所造成的，相反5-HT水平的下降促使了TPH2mRNA的表達，從而合成5-HT來彌補其水平的不足。另外，國內文獻報道，慢性不可預見性應激模型大鼠中樞海馬與中縫核5-HT水平及TPH2mRNA表達下降［7］。對于急、慢性抑郁模型中樞TPH2mRNA表達出現(xiàn)截然不同的結果，推測慢性應激模型TPH2mRNA表達下降可能是中樞5-HT下降后失代償?shù)慕Y果。

TPH2在中縫核5-HT神經(jīng)元和外周的腸肌間神經(jīng)元有顯著表達［8］。大鼠研究目前證實TPH2在腦中有特異性表達［9］。外周血TPH2與中樞TPH2有無關聯(lián)目前尚無定論。國外有研究發(fā)現(xiàn)TPH2基因敲除大鼠和TPH2／TPH1基因雙重敲除的大鼠中樞5-HT水平顯著下降；TPH2／TPH1基因雙重敲除的大鼠外周5-HT顯著下降，但是TPH2基因敲除大鼠外周5-HT水平無差異［10］，這提示了中樞 5-HT水平主要由TPH2調控，外周5-HT水平與TPH2無關。本研究實驗組與對照組在外周血粒細胞TPH2mRNA表達未顯示明顯差異，外周血TPH2的mRNA表達與動物的曠場行為間也未顯示相關，提示外周血粒細胞TPH2mRNA表達不能作為急性應激所致抑郁的外周生物學標記。

5-HT作為中樞一種抑制性神經(jīng)遞質，參與實現(xiàn)多個系統(tǒng)的生理功能，包括情緒控制、睡眠節(jié)律、疼痛感受、食物攝取及性行為等［11］。TPH2作為5-HT合成的限速酶，其水平的變化也會影響動物的認知及行為。國外一項研究發(fā)現(xiàn)TPH2基因是風險選擇行為測試的一個特質因素［12］。對于小鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)中樞TPH2低活性小鼠攻擊性下降，強迫游泳表現(xiàn)差，但在曠場試驗中無明顯變化［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)雄性TPH2基因敲除小鼠在曠場試驗中移動總里程及中央?yún)^(qū)時間顯著低于對照組［14］。此外，Hiroi等人發(fā)現(xiàn)大鼠中鋒背核延髓背內側TPH2mRNA表達與焦慮樣行為相關［15］。本研究發(fā)現(xiàn)曠場試驗行為學數(shù)據(jù)與中縫核、海馬TPH2mRNA表達均無相關（均P＞0.05）。其原因可能為曠場試驗的行為學太過簡單，在今后研究中可以加入其他行為學及認知測試加以完善。

中樞5-HT水平受包括合成、代謝和轉運等多方面的影響，本研究只觀察了合成環(huán)節(jié)中TPH mRNA的變化，僅僅反映可急性大鼠中樞TPH2合成中基因轉錄的情況，但并不沒有對TPH2酶的活性進行測定，此外研究未能同步檢測中樞的5-HT及其代謝物的水平，將在以后的研究中進一步的完善。

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（責任編輯：文飛）

* 上海交通大學附屬精神衛(wèi)生中心（上海 200030）

△華東師范大學

【中圖分類號】R749.4

【文獻標識碼】A

收稿日期：（2012－01－03）

doi：10.3969／j.issn.1002－0152.2012.08.013

項目基金☆號：國家自然科學青年基金（編號：81101007）；上海市科委醫(yī)學引導類項目 （編號：09411965600）

通訊作者（Email：ja＿1023＠yahoo.com.cn）