UPLC法測(cè)定中藥淡豆豉中3種主要異黃酮苷元的含量

柴 川 白永濤 文紅梅 宋利華 涂佳玉 單晨嘯

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029;2.河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453100

淡豆豉是由豆科植物大豆 ［Glycine max(L.)Merr.］的成熟種子和青蒿、桑葉等中藥經(jīng)發(fā)酵加工而成的制品，歷版《中國(guó)藥典》均有記載，為常用中藥，具有解表，除煩，宣發(fā)郁熱等功效，可用于感冒、寒熱、頭痛、煩躁、胸悶及虛煩不眠等癥［1］。淡豆豉處方大豆用量最高，大豆異黃酮類(lèi)為其主要活性成分，具有明顯改善心血管功能［2］，降低去卵巢大鼠膽固醇水平和調(diào)節(jié)血脂的功效［3－4］，緩解由于更年期雌激素不足所引起的骨質(zhì)疏松［5－6］。淡豆豉中異黃酮分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩類(lèi)，其中苷元比糖苷具有更強(qiáng)的生物活性和更高的生物利用度。淡豆豉中異黃酮測(cè)定方法以高效液相色譜 (HPLC)法最多［7－9］。本文建立了快速測(cè)定淡豆豉中大豆苷元 (Daidzein)、黃豆黃素(Glycitein)、染料木素 (Genistein)3種主要異黃酮苷元成分的超高效液相色譜法 (UPLC法)，與HPLC法相比，分析時(shí)間短，分析效率高，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可以更好地用于淡豆豉藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

儀器 Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀:包括在線(xiàn)真空脫氣系統(tǒng)，四元超高壓泵系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測(cè)器，Empower 2工作站。KQ－500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);Startorius BP211D電子天平 (德國(guó)Startorius公司)。

對(duì)照品 大豆苷元、黃豆黃素、染料木素均購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司 (經(jīng)UPLC分析純度均在98%以上)。乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

淡豆豉購(gòu)于南京市藥材公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王春根教授鑒定為由豆科植物大豆 ［Glycine max(L.)Merr.］的成熟種子和青蒿、桑葉等中藥經(jīng)發(fā)酵加工而成的淡豆豉制品，批號(hào):090810、090927、091025，產(chǎn)地為河南。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity BEH C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm，1.7μm);流動(dòng)相為乙腈－0.1%甲酸水溶液(24:76);檢測(cè)波長(zhǎng):260nm;進(jìn)樣量:1μL;柱溫:40℃;流速:0.4mL·min－1;樣品室溫度:4℃?；旌蠈?duì)照品和淡豆豉樣品的色譜圖見(jiàn)圖1，淡豆豉樣品中3種異黃酮苷元成分均達(dá)到基線(xiàn)分離。

圖1 大豆苷元、黃豆黃素、染料木素對(duì)照品色譜圖 (A)及淡豆豉樣品色譜圖 (B)

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別稱(chēng)取大豆苷元、黃豆黃素及染料木素對(duì)照品適量，分別置于100mL量瓶中，加80%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為110.7、62.6、105.5μg·mL－1對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備

取淡豆豉藥材粉末2g(過(guò)80目篩)，精密稱(chēng)定，置于50mL錐形瓶中，加80%甲醇20mL，超聲提取2次，每次30min，濾過(guò)，用80%甲醇洗滌濾渣，置50mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取大豆苷元、黃豆黃素、染料木素對(duì)照品貯備液各1mL，置于10mL量瓶中，并用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液;再依次逐級(jí)稀釋制成大豆苷元、黃豆黃素、染料木素濃度為 (11.07、6.26、10.55)、(5.535、3.13、5275)、(2.214、1.252、2.120)、(1.107、0.626、1.055)、 (0.5535、0.313、0.5275)、 (0.2214、0.1252、0.212)的溶液，分別進(jìn)樣1μL，以對(duì)照品的濃度X(μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程見(jiàn)表1。

表1 3種大豆異黃酮苷元的線(xiàn)性回歸方程和線(xiàn)性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液 (大豆苷元2.214μg·mL－1黃豆黃素1.252μg·mL－1染料木素2.120μg·mL－1)，按照上述的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以色譜峰面積計(jì)算，大豆苷元，黃豆黃素，染料木素的 RSD分別為0.52%，0.62%，0.71%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，計(jì)算得大豆苷元，黃豆黃素，染料木素峰面積的RSD分別為0.49% ，1.34% ，0.67% 。表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批淡豆豉藥材樣品 (090927)2g，共6份，精密稱(chēng)定，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算待測(cè)成分平均含量 (RSD%)，分別為大豆苷元137.7μg·g－1(1.34%)，黃豆黃素 29.69μg·g－1(2.83%)，染料木素128.8μg·g－1(2.05%)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)知含量的樣品 (090927)約2.0 g，共9份，分為3組，分別精密加入大豆苷元貯備液 (110.7μg·mL－1)2.0、2.5、3.0mL，黃豆黃素貯備液 (62.6μg·mL－1)0.75、1.0、1.25mL及染料木素貯備液 (105.5μg·mL－1)2.0、2.5、3.0mL，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試溶液，按上述色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算回收率。其平均回收率及 RSD值分別為 100.5% (3.87%)、99.06%(2.26%)、97.84%(1.60%)。

2.9 樣品測(cè)定

取不同批次的淡豆豉樣品粉末2g，精密稱(chēng)定，各3份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算3種異黃酮苷元的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 淡豆豉藥材中大豆苷元，黃豆黃素，染料木素的測(cè)定結(jié)果(X/μg·g－1± SD)

3 討論

3.1 色譜條件選擇 分別比較了甲醇－水、乙腈－水體系和甲醇－甲酸水、乙腈－甲酸水體系，甲醇－水、乙腈－水體系中異黃酮色譜峰形稍顯拖尾，而甲醇－甲酸水，乙腈－甲酸水體系中色譜峰形對(duì)稱(chēng)。經(jīng)優(yōu)化選擇乙腈－0.1%甲酸水 (24:76)為流動(dòng)相，在此色譜條件下3種異黃酮成分色譜峰均達(dá)到基線(xiàn)分離，峰形對(duì)稱(chēng)，大豆苷元、黃豆黃毒、染料木素的保留時(shí)間分別為2.35、2.72、4.50min，樣品分析時(shí)間為5min。本文建立的UPLC測(cè)定淡豆豉中異黃酮苷元的方法與普通HPLC法［7－9］比較，分析速度提高了5～8倍，同時(shí)也具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和耐用性。3.2 供試品制備方法的選擇 選擇簡(jiǎn)便的超聲處理(250W，50KHz)方式提取淡豆豉中異黃酮苷，對(duì)提取溶劑(40%甲醇，80%甲醇、甲醇)、提取次數(shù) (1、2、3次)進(jìn)行考察，以80%甲醇超聲處理2次，可將淡豆豉中異黃酮苷元提取完全。

4 結(jié)論

淡豆豉中大豆異黃酮的含量測(cè)定，文獻(xiàn)報(bào)道中主要對(duì)大豆苷元 (大豆黃素)和染料木素進(jìn)行測(cè)定，本文建立的同時(shí)測(cè)定大豆苷元、黃豆黃素和染料木素3種異黃酮類(lèi)成分的快速測(cè)定方法，為更好地評(píng)價(jià)和研究淡豆豉藥材的質(zhì)量提供了新方法。

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