膀胱移行細(xì)胞癌組織中p57kip2mRNA表達(dá)變化

葛 雷，曲曉偉，胡建庭，單中杰，韓前河，楊慶祥，翟曉磊，趙 陽

(鄭州人民醫(yī)院，鄭州450003)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，尤以移行細(xì)胞癌為多見，其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確［1］。有研究表明細(xì)胞周期分布的改變與細(xì)胞癌變密切相關(guān)，許多癌基因、抑癌基因參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。p57kip2作為候選抑癌基因，其表達(dá)與大腸癌、上皮性卵巢癌、肝癌、甲狀腺癌、肝外膽管癌及肝內(nèi)膽管癌等發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切［2］，而與膀胱癌的關(guān)系報(bào)道仍較少。2011年8月～2012年4月，我們檢測并比較了26例膀胱移行細(xì)胞癌組織和19例癌旁正常組織中的p57kip2mRNA?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集鄭州人民醫(yī)院26例原發(fā)性膀胱移行細(xì)胞癌患者手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本，為觀察組。26例患者中男18例，女8例;年齡28～78歲，平均62.6歲。在遴選病例時(shí)將有酗酒和過量吸煙(＞20支/d)等不良嗜好者及化工制造從事業(yè)者等膀胱癌高危人群剔除。另取19例癌旁正常組織標(biāo)本為對照組。

1.2 p57kip2mRNA檢測方法 將組織研碎，按50～100 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)加入Trizol，冰上放置5 min;然后加入200 μL氯仿，快速震蕩15 s，冰上放置10 min后，4℃、15 000 r/min離心15 min;仔細(xì)吸取上層水相，移至另一支EP管中;加入等體積(約500 μL)異丙醇，冰上放置10 min;4℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，加入75%乙醇(焦碳酸二乙酯處理滅菌水配制)500 μL，充分洗滌沉淀物;4℃、10 000 r/min離心5 min后棄上清，室溫干燥3 min，DEPC處理滅菌純水20 mL溶解RNA沉淀;分光光度計(jì)測定總RNA產(chǎn)物量及純度，提取的RNA置于－80℃冰箱凍存。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物［1，2］。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性5 min，然后按95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

制備2%的瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠0.5 μg/ mL。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL與上樣緩沖液1 μL混勻，加入加樣孔。電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳條件為80 V電壓，45 min。在β-actin同時(shí)擴(kuò)增出來的前提下，擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外燈下呈明亮的橙色熒光，其所處的位置與該目的基因片段長度相符，即為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組26例(38.45%)、對照組19例(100%) p57kip2mRNA表達(dá)陽性，兩組p57kip2mRNA陽性表達(dá)率相比，P＜0.05。

3 討論

膀胱癌在我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中占首位，以移行細(xì)胞癌為主。盡管人們已經(jīng)對膀胱癌的病因、病理、診斷和治療等進(jìn)行了深入的研究，但其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確。膀胱癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟、復(fù)雜的漸進(jìn)過程，其病程的發(fā)展和演進(jìn)也同樣涉及多個(gè)抑癌基因的失活和(或)癌基因的激活。研究表明細(xì)胞周期與細(xì)胞癌變密切相關(guān)，許多癌基因、抑癌基因參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，或者其本身就是細(xì)胞周期的組成部分，它們的改變導(dǎo)致了細(xì)胞周期的失控，表現(xiàn)為細(xì)胞的失控性生長，

p57kip2基因定位于染色體 11p15.5上的D11S648和Dl1S679之間約2.2 kb的區(qū)域內(nèi)［3，4］，屬CIP/KIP家族，與 p21、p27功能相似，通過與CDK結(jié)合而抑制CDK的功能使細(xì)胞周期停滯在G1期。Lee等［4］認(rèn)為p57kip2作為候選抑癌基因，其抑癌機(jī)制可能是p57kip2蛋白與Cyclin-CDK復(fù)合物相結(jié)合，阻止細(xì)胞增殖，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。Kondo等［5］認(rèn)為正常情況下，p57kip2基因?yàn)楦冈吹任换虮挥∮?，母源基因表達(dá)，在一些腫瘤中存在p57kip2基因印記缺失或印記錯(cuò)誤，導(dǎo)致基因表達(dá)下降。關(guān)于p57kip2蛋白在腫瘤組織中表達(dá)的研究多集中在大腸癌、上皮性卵巢癌、肝癌、甲狀腺癌、肝外膽管癌及肝內(nèi)膽管癌等。而有關(guān)p57kip2表達(dá)與膀胱癌關(guān)系報(bào)道較少。Nakai等［6］研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的病理組織階段、分化程度及患者的預(yù)后有密切關(guān)系，且在中、低度分化的肝細(xì)胞癌中，p57kip2基因有明顯的雜合性缺失，可認(rèn)為p57kip2基因表達(dá)下降或缺失是肝細(xì)胞癌晚期的表現(xiàn)。Oya等［7］利用RT-PCR技術(shù)檢測24例膀胱移行細(xì)胞癌和14個(gè)膀胱癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其中p57kip2達(dá)顯著下降，其中部分p57kip2表達(dá)缺失，說明p57kip2是一種在膀胱癌中影響母系染色體11p15.5的重要靶基因。本研究結(jié)果顯示膀胱移行細(xì)胞癌組織中p57kip2的陽性表達(dá)率要明顯低于癌旁正常組織，提示 p57kip2異常低表達(dá)與膀胱癌發(fā)病密切相關(guān)。理論上，作為一種細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，應(yīng)在正常組織中表達(dá)，而在腫瘤組織中會(huì)受到抑制而表達(dá)減少或表達(dá)缺失，導(dǎo)致細(xì)胞生長失控而惡變［8，9］。但是正性調(diào)控因子增加后，為達(dá)到細(xì)胞周期調(diào)控的平衡，可反饋性的引起負(fù)性調(diào)控因子的增高，直至腫瘤發(fā)生并惡化后這一平衡才被打破，負(fù)性調(diào)控因子的表達(dá)因而下降。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)p57kip2mRNA及蛋白表達(dá)與腫瘤的高臨床分期和預(yù)后有極大關(guān)系，說明p57kip2基因的失活在膀胱癌的進(jìn)展中起著一定的作用，并可能是一個(gè)新的預(yù)后指標(biāo)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［7～9］。關(guān)于 p57kip2基因在膀胱癌失活的具體機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究［10，11］。

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