組織工程血管移植在血液透析通路中的應用

張 攀 綜述 葉朝陽 審校

目前維持性血液透析(HD)患者使用的血管通路主要是動靜脈內瘺(AVF)、移植血管和帶滌綸套中心靜脈導管。主流觀點認為AVF首選[1]，移植血管其次[2]，最后考慮靜脈導管[3]。K-DOQ指南認為移植血管只用于自體AVF不能成熟、內瘺閉塞或者血管解剖條件不適合做內瘺的患者。移植血管的來源一般為患者自體血管、尸體血管、異種(動物)血管及人造血管。最好的移植血管是患者自體血管，一般是大隱靜脈[4]。脫細胞牛頸靜脈和人尸血管易發(fā)生血栓、動脈瘤及鈣化，在臨床上未廣泛接受[5-7]。聚四氟乙烯(PTFE)人造血管多用于口徑>6 mm的HD患者的移植血管通路。研究表明PTFE人造血管在一、二級通暢率，感染風險及住院風險上均次于自體AVF，但好于靜脈導管[2]。盡管PTFE人造血管使用廣泛，但相對于自體移植血管仍然存在明顯不足[8,9]，易發(fā)生感染、血栓、內膜增生、流出道或吻合口閉塞等[4,10]，平均通暢時間僅10月左右。此外，人工材料生物兼容性較差，不利細胞的正常生物行為[11]，也易造成移植性炎癥反應[12]。

組織工程是一種應用細胞生物學和工程學原理,將人體某部分的組織細胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進行人工培養(yǎng)繁殖,擴增,然后移植至人體內所需要部位,從而達到器官修復或再造的治療目的的技術。隨著組織工程技術的進步，組織工程血管(tissue-engineered blood vascular，TEBV)越來越多地應用于臨床。Shin’oka等[13,14]率先應用自體骨髓干細胞-高分子材料種植技術構建組織血管，并成功用于壓力較低的兒童患者肺動脈流出道的修復。然而這種方法構建的血管不具備足夠的機械強度，不能用于成人的動脈搭橋。其他用類似方法構建的血管也未能獲得足夠應用于臨床的抗壓強度[15,16]。要將TEBV用于制作透析血管通路，必須要使構建的血管獲得足夠的機械強度與生物兼容性。為此，國外的專家已經進行了初步的嘗試并取得了令人鼓舞的成果。

分層構建法構建的TEBV

分層構建法與簡化分層構建法1998年出現的分層構建法，可獲得具有足夠機械強度的TEBV。L’Heureux等[17]采用三種血管細胞預先培養(yǎng)再組合形成具板層結構類天然血管的純生物材料。他們先分別培養(yǎng)人臍靜脈平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)和人皮膚成纖維母細胞(fibroblast，FB)于培養(yǎng)瓶，用條件化培養(yǎng)液培育30d后，形成由細胞和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)構成的膜片狀培養(yǎng)物。將FB膜片從瓶壁上剝離，包裹在惰性管軸外繼續(xù)培養(yǎng)，在成熟期膜片相互緊密黏合，產生圓柱狀培養(yǎng)物。FB管膜經脫水處理制成無細胞的內膜。組裝時，(1)將內膜套在PTFE多孔管軸外，軸外徑3 mm，再裹上SMC膜片，制作血管中膜，此時將構建物置于生物反應器，培養(yǎng)液同時通過管腔和管外回流，支持管壁細胞生長；(2)裹上FB膜作為外膜，待管壁細胞和ECM培育成熟；(3)脫去中心管軸，管內接種內皮細胞(endothelial cells，EC)總時程3月培育出了具有活性細胞的，并且類似機體血管板層結構的TEBV。該血管壁SMC和EC都表現出分化狀態(tài)，血液相容性好，能耐受2 000 mmHg的靜水壓，動物體內短期移植(7d)顯示易于手術操作,縫合性良好。這種TEBV制成，是血管組織工程領域一大突破，顯示了通過細胞成分培養(yǎng)構筑功能性血管的可能性。

此后，Peck等[18]對上述分層構建法進行了簡化，以成纖維母細胞為種子，培養(yǎng)8周形成生物膜后，包繞在有PTFE涂層的不銹鋼軸上繼續(xù)培養(yǎng)10周，使其形成管狀膠原支架。此方法的特點是取消了中層的SMC，其優(yōu)勢在于減少血管培養(yǎng)所需的細胞類型，進而減少培養(yǎng)細胞所需要的培養(yǎng)條件和附加質量控制措施。雖然在自體血管中SMC層的收縮功能在血壓控制中發(fā)揮著重要的作用，但對移植血管的通暢性并無明顯影響。此外，血清培養(yǎng)的SMC細胞具有高增生性，取消中層的SMC也就避免了內膜增生的風險[19]。

簡化分層構建血管在動物模型上的研究2006年L’Heureux等[20]一系列成功的動物實驗證明了這種簡化的TEBV的有效性,被命名為“LifelineTMgrafts”，構建血管的細胞取自56～79歲的血管搭橋術患者，動物模型有犬、裸鼠及恒河猴。免疫抑制犬模型(4例)為14d短期評估，組織學顯示存在巨大免疫反應。裸鼠模型實驗分兩組，第一組(13例)使用的是單層的1.5 mm內徑血管(無內膜)，被移植到動物的腹主動脈上，225d后總通暢率85%，但觀察到血管內徑增加，提示血管強度需進一步加強。第二組(14例)使用的是包含內膜的雙層血管[9個片段，平均抗壓強度(3 688±1 865)mmHg]，225d后總通暢率86%。與第一組不同的是血管口徑保持穩(wěn)定，顯示該血管有足夠的機械強度。鏡下顯示血管與周圍組織融合良好，組織學評估證實血管與自體組織完全融合。長期移植未出現血栓，說明在術后無抗血小板治療的情況下，此種血管具有良好的抗血栓能力。此外，第180天血管腔內未見內皮細胞定殖，從側面說明管腔內未種植內皮細胞的移植血管是可以保持通暢的。血管成熟性方面：第90天可見中層存在稀薄的α肌動蛋白陽性的SMC及內膜有融合的內皮細胞。Movat染色，“中層”含有清晰的彈性薄層及大量粘多糖。第180天，中層厚度無改變，彈性層密度增加，黏多糖不可見。這些變化提示血管達到成熟與重建過程的平衡。此過程中殘存的可溶性膠原支架在數周內完全降解[21]。為了進一步對該移植血管進行臨床相關性及生化環(huán)境的評估，學者們采用了免疫抑制靈長目模型恒河猴3只[內徑4.2 mm，5個片段，平均抗壓強度(3 468±500)mmHg]，1例移植于髂動脈，2例移植于腹主動脈。盡管是異種血管移植，存在輕微的免疫反應，6～8周后所有移植血管被取出，所有血管通暢，未見血管瘤或管腔狹窄，內膜未見內皮細胞增生。組織學分析顯示血管重建比裸鼠模型要輕，也許是因為移植時間較短或者采用了免疫抑制，也可能是兩種模型本質上的差別。

LifelineTMTEBV作為HD通路的臨床研究2007年L’Heureux等[22]報道了6例首批接受LifelineTMTEBV移植的患者，參與患者均為終末期腎病，年齡29～89歲(68±17歲)，每周透析3次。所有患者均為PTFE移植血管失敗，該研究應用LifelineTM血管作為動靜脈搭橋HD通路。所構建TEBV長20～40 cm，都用于上臂血管通路。早期(3月內)血管通暢，患者未見不良反應。生物機械測試顯示LifelineTMgrafts平均強度3 490±892 mmHg(230個片段,25例患者)，高于人大隱靜脈(1 599±877 mmHg,7個片段)，并具有可重復性[(3 238±366)mmHg、6個片段vs(3 561±435)mmHg、25個片段][23]。2009年McAllister等[24]的一項隊列研究共納入10例患者，9例成功接受上臂血管移植，1例因為消化道出血退出。1例移植后39d死于無關病因，死亡時移植血管通暢。1例患者移植后第3天出現急性免疫反應并出現血管瘤，可能是因為培養(yǎng)血管的新型牛血清中IgG水平較高所致，因為使用去IgG的牛血清培養(yǎng)的血管的患者未發(fā)生免疫反應。有3例前90d失敗，低于AVF預期[25,26]；余下5例保持通暢6～20月，總通暢時間為68個患者月；其中1例患者需要手術干預?？傮w初始通暢率(1月)78%(7/9)，半年通暢率60%(5/8)。通路事件率為0.7/患者年，優(yōu)于PTFE移植血管[27]。盡管此項研究說明TEBV臨床應用于透析血管通路在理論與實踐上是可行的，但仍存在局限性：(1)病例數較少，需要更大樣本與更長時間的觀察；(2)造價高昂[28]，每根移植血管造價≥15 000美元，不太符合臨床移植血管的選擇標準；(3)患者單獨培養(yǎng)血管需要耗時6～9個月，不適用于需要緊急干預者。

脈動生物反應器構建TEBV

脈動生物反應器構建TEBV的方法Niklason等[29]將SMC懸液注入生物可降解聚合物材料聚乙醇酸(PGA)制成管形支架中，細胞貼壁后，用近似大哺乳動物胎兒發(fā)育環(huán)境，產生脈動流和環(huán)流的生物模擬培養(yǎng)系統(tǒng)培育。培育8周中，SMC遷入PGA骨架內，其在PGA降解的同時，分泌膠原等ECM。當ECM與細胞一起形成的腎小管結構替代PGA支架時，管腔內接種EC生物模擬培養(yǎng)系統(tǒng)使培養(yǎng)液在管腔中不斷流動(產生一定的剪切力)，并通過脈沖泵的控制使流體產生有節(jié)律的脈動波以刺激細胞成熟。該實驗顯示，脈動培養(yǎng)條件利于SMC遷移、分化表型表達(細胞內肌球蛋白量增多，細胞保持收縮反應，細胞有絲分裂率無增大)及細胞分泌膠原/ECM。體外培養(yǎng)可達到近似體內的細胞密度及膠原含量。在此種物理力學環(huán)境和優(yōu)化培養(yǎng)渣中培養(yǎng)出的血管，其機械力學性能優(yōu)于先前任何一種TEBV，抗脹裂強度/靜水壓大于2 000 mmHg，縫合固持強度達90g，膠原含量超過50%。管壁細胞具有良好的分化狀態(tài)，更新率低。血管對藥物作用產生收縮反應。動物自體移植4周，TEBV仍通暢，血液流動良好，異體移植通暢性大于無脈動培養(yǎng)。組織學檢查，血管無炎癥反應。這一模式首創(chuàng)脈動培養(yǎng)，革新了體外TEBV培育條件。

生物反應器構建組織工程化血管的動物模型研究2011年，Dahl等[30]采用此構建法，以人尸體來源SMC為種子細胞，構建口徑3～6 mm的TEBV。得到的膠原纖維基質無需內皮細胞化，經干燥滅活及去抗原性后在狒狒模型上作為動靜脈搭橋(內徑6 mm 頸動脈-肱靜脈)，共手術9例，1例因傷口感染退出，余下8例中有1例術后3月出現栓塞，考慮可能為技術失敗。觀察6月通暢率為88%(7/8)，未見動脈瘤、血管鈣化及內膜增生。異種移植未出現炎癥反應，具有良好的生物兼容性及免疫耐受性。檢測該血管伸展強度(178±11)g，最大抗靜水壓強度(3 337±343)mmHg，高于大隱靜脈。該血管還可存儲于PBS液中4℃可保存12月及以上。

生物反應器構建的TEBV有希望應用于HD通路的制作盡管生物反應器構建TEBV還未進入臨床試驗，但其具有的某些特點，有望成功用于制作HD通路:(1)有足夠的機械穩(wěn)定性，可事先確定管徑大小，且無分支，優(yōu)于尸體血管。(2)用于制作血管通路時，不必要在管腔內種植內皮細胞(內皮化)。因為血液透析血管通路的口徑一般>5 mm，血流量>500 ml/min，這種條件下省去內皮化不會增加凝血的風險，同時能有效降低成本，節(jié)省了寶貴的手術時間。如需要用于冠脈搭橋(口徑<3 mm)，為減小血管狹窄的風險，也可在已構建好的血管基礎上再種植內皮細胞[24，31]，其來源為脂肪組織[32]或外周血[33，34],方便快速，患者只需等待數周乃至數天。(3)使用異體SMC構建血管可不必對每例患者單獨進行血管構建，能大量生產進而商業(yè)化，利于急診應用。(4)這種血管的主要成分是滅活的脫細胞基質，因此可以長時間存儲，簡化運輸條件及省去一些質量控制手續(xù)。

小結：化學材料被組織工程材料取代是醫(yī)學發(fā)展的一個趨勢[35]。我國透析人群總數在逐年擴大，高齡透析患者比例上升，透析時間的延長，對HD血管通路的建立和維護提出了巨大的挑戰(zhàn)。對于血管條件不好的患者，采用移植TEBV建立血管通路應該是可行的，而且是必要的。組織工程作為一門新興的交叉學科，如何更好的服務于臨床，服務于患者，是轉化醫(yī)學的基本要求，也是醫(yī)療臨床、基礎工作者共同努力的方向。

1 Allon M.Fistula first:recent progress and ongoing challenges.Am J Kidney Dis,2011,57(1):3-6.

2 Kim DS,Kim SW,Kim JC,et al.Clinical analysis of hemodialysis vascular access:comparision of autogenous arterioveonus fistula & arteriovenous prosthetic graft.Korean J Thorac Cardiovasc Surg,2011,44:25-31.

3 Lacson E Jr,Wang W,Lazarus JM,et al.Change in vascular access and hospitalization risk in long-term hemodialysis patients.Clin J Am Soc Nephrol,2010,5(11):1996-2003.

4 Collins AJ,Foley RN,Herzog C,et al.Excerpts from the US renal data system 2009 annual data report.Am J Kidney Dis,2010,55(1 suppl 1):S1-420,A6-7.

5 Sharp MA,Phillips D,Roberts I,et al.A cautionary case:the SynerGraft vascular prosthesis.Eur J Vasc Endovasc Surg,2004,27(1):42-44.

6 Dohmen P,Liu J,Lembcke A,et al.Reoperation in a Jehovah’s Witness:22 years after aortic allograft reconstruction of the right ventricular outflow tract.Texas Heart Inst J,2003,30(2):146-148.

7 Madden RL,Lipkowitz GS,Browne BJ,et al.A comparison of cryopreserved vein allografts and prosthetic grafts for hemodialysis access.Ann Vasc Surg,2005,19:686-691.

8 Huber TS,Buhler AG,Seeger JM.Evidence-based data for the hemodialysis access surgeon.Semin Dial,2004,17(3):217-223.

9 Perera GB,Mueller MP,Kubaska SM,et al.Superiority of autogenous arteriovenous hemodialysis access:Maintenance of function with fewer secondary interventions.Ann vasc surg,2004,18(1):66-73.

10 Schild A,Perez E,Gillaspie E,et al.Arteriovenous fistulae vs.arteriovenous grafts:a retrospective review of 1,700 consecutive vascular access cases.J Vasc Access,2008,9(4):231-235.

11 Babensee JE.Interaction of dendritic cells with biomaterials.Semin Immunol,2008,20(2):101-108.

12 Engelsman AF,van der Mei HC,Ploeg RJ,et al.The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction.Biomaterials,2007,28(14):2314-2327.

13 Shin’oka T,Imai Y,Ikada Y.Transplantation of a tissue-engineered pulmonary artery.N Engl J Med,2001,344(7):532-533.

14 Shin’oka T,Matsumura G,Hibino N,et al.Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells.J Thorac cardiovasc surg,2005,129(6):1330-1338.

15 McKee JA,Banik SS,Boyer MJ,et al.Human arteries engineered in vitro.EMBO Rep,2003,4(6):633-638.

16 Poh M,Boyer M,Solan A,et al.Blood vessels engineered from human cells.Lancet,2005,365(9477):2122-2124.

17 L’Heureux N,Pquet S,Labbé R,et al.A completely biological tissue-engineered human blood vessel.FASEB J,1998,12(1):47-56.

18 Peck M,Dusserre N,McAllister TN,et al.Tissue engineering by self-assembly.Materials Today,2011,14:218-224.

19 Pauly RR,Passaniti A,Bilato C,et al.Migration of cultured vascular smooth muscle cells through a basement membrane barrier requires type IV collagenase activity and is inhibited by cellular differentiation.Circ Res,1994,75(1):41-54.

20 L’Heureux N,Dusserre N,Konig G,et al.Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.Nat Med,2006,12(3):361-365.

21 Morimoto N,Saso Y,Tomihata K,et al.Viability and function of autologous and allogeneic fibroblasts seeded in dermal substitutes after implantation.J Surg Res,2005,125(1):56-67.

22 L’Heureux N,McAllister TN,de la Fuente LM.Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.N Engl J Med,2007,357(14):1451-1453.

23 Konig G,McAllister TN,Dusserre N,et al.Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.Biomaterials,2009,30(8):1542-1550.

24 McAllister TN,Maruszewski M,Garrido SA,et al.Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft:a multicentre cohort study.Lancet,2009,373(9673):1440-1446.

25 Dember LM,Beck GJ,Allon M,et al.Effect of clopidogrel on early failure of arteriovenous fistulas for hemodialysis:a randomized controlled trial.JAMA,2008,299(18):2164-2171.

26 Gibson KD,Gillen DL,Caps MT,et al.Vascular access survival and incidence of revisions:a comparison of prosthetic grafts,simple autogenous fistulas,and venous transposition fistulas from the United States Renal Data System Dialysis Morbidity and Mortality Study.J Vasc Surg,2001,34(4):694-700.

27 Perera GB,Mueller MP,Kubaska SM,et al.Superiority of autogenous arteriovenous hemodialysis access:maintenance of function with fewer secondary interventions.Ann Vasc Surg,2004,18(1):66-73.

28 McAllister TN,Dusserre N,Maruszewski M,et al.Cell-based therapeutics from an economic perspective:primed for a commercial success or a research sinkhole?Regen Med,2008,3(6):925-937.

29 Niklason LE,Gao J,Abbott WM,et al.Functional arteries grown in vitro.Science,1999,284:489-493.

30 Dahl SL,Kypson AP,Lawson JH,et al.Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts.Sci Transl Med,2011,3(68):68ra9.

31 Deutsch M,Meinhart J,Zilla P,et al.Long-term experience in autologous in vitro endothelialization of infrainguinal ePTFE grafts.J Vasc Surg,2009,49(2):352-362.

32 Arts CH,Heijnen-Snyder GJ,Joosten PP,et al.a novel method for isolating pure microvascular endothelial cells from subcutaneous fat tissue ideal for direct cell seeding.Lab Invest,2001,81(10):1461-1465.

33 Kalka C,Masuda H,Takahashi T,et al.Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(7):3422-3427.

34 Hill JM,Zalos G,Halcox JP,et al.Circulating endothelial progenitor cells,vascular function,and cardiovascular risk.N Engl J Med,2003,348(7):593-600.

35 Olson JL,Atala A,Yoo JJ.Tissue Engineering:Current Strategies and Future Directions.Chonnam Med J,2011,47(1):1-13.