人乳頭瘤病毒與宮頸癌關系的研究進展

張志勇 綜述,施橋發(fā) 審校

(1、江西省人民醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2、南昌大學醫(yī)學院基礎免疫學教研室，江西 南昌 330006)

乳頭狀瘤病毒首先于1907年在人類疣中發(fā)現(xiàn)，1983年Richard Shoppe 首先從兔中分離出乳頭狀瘤病毒。在19 世紀70年代前，子宮頸癌長期以來被認為是一種性傳播因子引發(fā)的疾病[1]，直至1972年，德國科學家Zur Hansen 在對宮頸癌風險因素探索研究的基礎上首次提出宮頸癌可能由HPV 感染引起，從而引起了學者對HPV的深入研究。近幾十年來的研究表明，高危型HPV 從腫瘤的啟動、發(fā)生、發(fā)展及惡性表形的全過程都密切相關，是與人類腫瘤關系最為密切的腫瘤病毒。本文就其最新的研究進展作一綜述。

1 生物學特性

1.1 HPV的分子生物學特性 乳頭瘤病毒(papilloma virus,PV)是一組無包膜的小DNA 病毒，屬乳頭瘤病毒科，可感染人和多種高級脊椎動物的皮膚及黏膜上皮組織，其中感染人類的稱為人乳頭瘤病毒(Human pap;lilloma virus,HPV)。HPV 通常為直徑52～60nm的正十二面體結構，病毒顆粒含有一條約8kb 堿基對雙鏈DNA,外包以病毒衣殼。所有的HPV 基因組均有8個開放讀碼框架，8個開放讀碼框架僅從一條DNA 上譯碼，HPV 基因組從功能上分為三部分：(1)早期區(qū)，編碼E1-E7 蛋白，是病毒復制的必需部分；(2)晚期區(qū)，編碼L1和L2 蛋白，是病毒組裝所必需部分；(3)長調控區(qū)(LCR)，其中包括病毒復制和轉錄所需要的多個cis 元件。

1.2 HPV的分型 訖今為止，已分離出不同基因型的HPV 達100個以上，其中超過40種可以感染肛門、生殖道或其他部位的內皮或黏膜上皮。根據(jù)HPV與誘發(fā)上皮組織增生的惡性程度不同，可以將其分為低危型HPV，包括HPV6、11、42、43等，通常引起生殖器濕疣、尖銳濕疣和非惡性病變[2]，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等類型，通常引起重度非典型性增生與宮頸癌。但大多數(shù)情況下，機體的免疫系統(tǒng)能在HPV 感染引發(fā)腫瘤之前將其清除[3]，僅有少部分高危型HPV 感染者發(fā)展成惡性腫瘤。

2 HPV 感染的流行病學情況

有關HPV 感染率的研究，由于檢測標本的來源、使用的HPV 檢測技術、檢測的HPV型別及研究地區(qū)人群的不同，各研究的HPV 感染陽性率各有不同。美國2006年調查顯示，美國有2 千萬HPV 感染者，每年新發(fā)感染有62萬[4]，其中女性比男性要高2倍。WHO/IARC 于2004年至2005年在我國對不同地區(qū)3000個不同年齡段的婦女進行的HPV 患病率調查顯示[5-7]，中國婦女HPV 感染率在15%以上。

HPV 感染一般來說是通過生殖道接觸傳播。影響HPV 感染率的因素有多種，性行為是最主要因素，有研究顯示有多個性伴侶的人在其一生中HPV 感染率為20.1%，同時只有一個性伴侶的人群感染率為7%[8],其他包括吸煙、長期使用激素類避孕藥和性病史也是影響HPV 感染率的重要因素[9，10]。研究表明，大約有90%的HPV 陽性組織在2年內轉為陰性[11]，10%以下的感染個體的宮頸上皮出現(xiàn)異常增生，但大多數(shù)處于平穩(wěn)期。雖然大部分婦女在其一生中都至少感染一種HPV 亞型，但是這些感染人群患子宮頸癌的風險有多高目前尚不清楚，它取決于個體感染HPV的型別及機體的免疫功能。人乳頭狀瘤病毒不僅影響到婦女，甚至感染男性。HPV也能在男性之間進行傳播，有文獻報道，男同性戀者中肛門HPV 感染率高，發(fā)生HPV相關肛門癌的危險性也高[12]，但以收集男性標本做HPV-DNA的敏感方法最近才得到發(fā)展，所以對于男性HPV的感染因素及其自然史，目前還缺少相關資料。

3 HPV 致子宮頸癌的主要機制

自Zur Hansen 在子宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18 以來，世界各國科學家研究發(fā)現(xiàn)除HPV16和HPV18外，另有HPV31、HPV34等14種型別的HPV可在人的生殖器、鼻咽部、食道等部位引發(fā)惡性腫瘤，并在其惡性腫瘤組織中檢測出較高的HPV 感染率，并且存在與導致宮頸癌相似的致癌機制[13]。

對高危性HPV 如何引起子宮的惡性變化最終誘發(fā)子宮頸癌這一課題，科學家利用分子生物學、免疫學和遺傳學的技術方法進行了深入的研究。在體內和體外研究均表明，HPV與宮頸癌的關系最重要三個致癌基因為E5、E6、E7[14]。E5 蛋白能與多種細胞生長因子受體結合，通過活化多種細胞因子的受體信號通路刺激細胞增殖[15],它對于病毒的DNA 整合到宿主基因組這一個腫瘤啟動的關鍵步驟發(fā)揮了重要作用。E6 蛋白通過E6-AP的介導與P53 抑癌基因蛋白結合，在E6-Ap-ubiquitin蛋白酶的作用下，促使P53 蛋白進入泛素依賴的降解途徑，改變G1期進入S期的調控點，細胞進入S期，導致突變增加、DNA的完整性受損。而且P53的降解還導致抑癌基因的功能降低，同時啟動細胞周期，抑制細胞凋亡。E6 還作用于其他蛋白，包括點狀粘蛋白paxillin和干擾素調節(jié)因子3，E6蛋白與干擾素的作用阻斷了病毒對INF-β 誘導作用[16]。E6 還可使惡變的細胞對于TNF-α 介導的AP 復合物的改變不產(chǎn)生反應[17]。而E7 蛋白則與細胞RB 基因蛋白及其相關蛋白的相互作用，隨繼從RB 基因復合物釋放出EF2 轉錄激活因子，E2F可與DNA 結合，活化促進細胞增殖相關基因的表達，使細胞過度增殖，最終導致細胞的永生化或腫瘤的發(fā)生[18，19]?？傊?，HPV與宿主基因整合、HPV 對細胞周期與細胞凋亡的影響、原癌基因和端粒酶的活化，被認為是HPV 誘發(fā)子宮頸癌變的關鍵因素。

4 HPV的檢測方法

研究表明，99.7%的浸潤型宮頸癌中可檢測到HPV的存在[20]。HPV 檢測對宮頸癌的診斷與預防有著重要意義，目前在醫(yī)院和實驗室已開展多種實驗項目對HPV 進行檢測，其常用檢測方法如下。

4.1 巴氏涂片細胞病理學檢測

凹空細胞是HPV 感染的主要形態(tài)學改變，在宮頸移行區(qū)取材進行巴氏染色可見由HPV 引起的凹空細胞，即可診斷。近年來隨著技術的進步，傳統(tǒng)的巴氏涂片法發(fā)展為液基薄層細胞技術(Thinprep cytologic test，TCT)和涂片自動檢測系統(tǒng)[21]。TCT 操作標準化，人為影響因素較少，其檢測的準確度高于傳統(tǒng)的巴氏涂片法，目前在臨床上已規(guī)模用于普查和篩查[22]，但由于其他病毒感染和人為因素均可造成細胞內凹空性變，加之取材、染色以及人為主觀判斷的影響，TCT 法檢測HPV 仍存在靈敏度較低、特異性不高的缺點，此外也不能進行HPV 分型。

4.2 分子生物學法

4.2.1 PCR 檢測HPV-DNA 以基因擴增為基礎檢測HPV-DNA，是目前靈敏度最高的檢測方法。PCR 不僅可以應用于檢測病毒負荷定量、DNA 測序、突變分析，還可用于多重擴增，同時檢測多個DNA 序列。PCR 具有操作簡單，標本來源不受限制等特點，因此PCR 檢測是目前進行HPV-DNA 檢測及分型的最好辦法[23]。但是高靈敏性導致它容易由于標本的污染而導致假陽性結果，而且在進行HPV 分型時一次性檢測的樣本數(shù)目有限，限制了其在大規(guī)模篩查中的應用。PCR 法包括型特異性PCR 檢測、實時熒光定量PCR 檢測(FQ-PCR)、通用引物PCR 檢測等。

4.2.2 PCR 產(chǎn)物分型檢測 通用引物PCR的擴增產(chǎn)物可用直接測序法、限制片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、雜交分析、基因芯片實現(xiàn)基因分型。直接測序法是HPV 檢測的金標準，能檢測到所有的型別，并可避免雜交反應所固有的交叉反應，對檢測出新發(fā)現(xiàn)的型別有著重要作用，但是混合感染時，可能一種型別占絕對優(yōu)勢，這就無法辨別出含量少的型別，造成假陰性，將混合型判定為單一型[24]。RFLP 是選擇合適的限制性核酸內切酶，并根據(jù)特定的酶切條帶模式判斷HPV型別。雜交分析是最常用的檢測PCR 產(chǎn)物的方法。雜交法敏感度高，并對多重感染的檢測能力較高，可以判斷HPV的多重感染及型別，目前常用于HPV型別分布的統(tǒng)計中[25]。但其缺點是只能用于檢測已知的某些常見型別，對未知型別及變異型的HPV 不能檢測,而且不能排除交叉雜交的可能性?；蛐酒遣捎迷缓铣苫蝻@微點樣技術將DNA 探針固化于支持物表面，產(chǎn)生二維DNA 探針陣列，然后與標記的樣本進行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)快速、高效的檢測?；蛐酒s交可實現(xiàn)一次性對大批量標本進行檢測分析，具有通量高、速度快、信息量大、所需樣本少、污染少等特點。研究顯示基因芯片的靈敏度和特異性較其他方法高，其敏感性高達96.0%[26]。但目前基因芯片技術的成本昂貴，如在將來能降低其技術成本，將有廣闊的發(fā)展前景。

4.2.3 雜交捕獲法 雜交捕獲法是利用兩套全長RNA 探針與HPV 核酸雜交，再通過抗體捕獲信號的放大和化學發(fā)光信號的檢測，來確定HPV 存在與否。根據(jù)此法，美國Digene 公司先后開發(fā)出HCⅠ、HCⅡ、HCⅢ、HC Express Array等幾代產(chǎn)品，其中HCⅡ是通過化學熒光法來定量檢測病毒DNA，可同時檢測13種高危型和5種低危型HPV型別，該技術敏感性好、重復性高，是目前唯一通過FDA批準的可在臨床使用的HPV 檢測技術[27]，但缺點是不能進行HPV 分型。HCⅢ用一段帶有生物素的寡核苷酸代替HCⅡ中的特異性抗體，減少了非特異性造成的假陽性結果,但也不能進行HPV 分型。HC Express Array 技術則利用芯片上固定病毒不同亞型的特異性DNA 探針，對病毒DNA 進行分型判斷，具有廣闊的應用前景。

4.3 免疫學檢測 主要是利用經(jīng)重組技術表達的抗原來檢測患者血清中相應的抗體，或抗原免疫動物制備免疫血清，或單克隆抗體檢測組織或局部黏液中HPV 抗原。臨床常用免疫吸附法檢測HPV 中L1 類病毒顆粒的IgM和IgG 抗體以及HPV的E6、E7的特異性抗體蛋白等。另外也可利用免疫組織化學法檢測高危型HPV的早期基因蛋白E6、E7，早期基因蛋白的存在能有效的證明組織中存在HPV 感染。但由于血清學檢測的對象是抗原和抗體，人體對HPV 感染產(chǎn)生免疫應答有一定的遲滯性，同時HPV 病毒不能在體外培養(yǎng)增殖，所以血清學檢測對無免疫應答者和HPV 潛伏期感染者會產(chǎn)生漏檢。

4.4 多種檢測方法的聯(lián)合應用 單一方法檢測均有缺點，臨床多采用聯(lián)合多種檢測方法以提高準確性。高娜等[28]研究發(fā)現(xiàn)，將HPV-DNA 檢測和細胞學檢查聯(lián)合應用進行宮頸癌及CIN的篩查，其效率大為提高。而在篩查宮頸癌的最佳方案中，HCⅡ與細胞學聯(lián)合檢測是最佳方案[29]。

5 HPV 疫苗

5.1 HPV 疫苗的分型 HPV 疫苗可分為預防性和治療性兩種類型。HPV 預防性疫苗可阻斷HPV 感染皮膚和黏膜，一般由病毒衣殼蛋白L1 或L1+L2組成，在細胞內可自我組裝成空心病毒樣顆粒(VLPs)[30]，它具有與完整病毒相同的抗原空間表位，可激發(fā)機體的CD4+淋巴細胞介導的體液免疫反應，刺激機體產(chǎn)生保護性中和抗體。預防型疫苗種類較少，主要以HPV 病毒的結構蛋白質形式存在，其不含病毒DNA和癌蛋白，因而具有較高的免疫原性和安全性。隨機臨床試驗顯示，預防性HPV 疫苗對治療HPV 感染是有效的[31,32]。

HPV治療性疫苗可清除由HPV 感染所引起的腫瘤殘存病灶、宮頸不典型增生(CIN)及生殖器尖銳濕疣，阻斷低危型病變向高危型病變及癌癥的轉變過程。治療疫苗多將E6和E7 蛋白作為靶抗原，理想的治療性疫苗可以使機體產(chǎn)生HPV 特異性細胞毒性T細胞(CTL)。目前研究的治療性疫苗主要有重組牛痘病毒疫苗、a 病毒載體疫苗、腺病毒載體疫苗、細菌載體疫苗、基因疫苗、肽段疫苗、p16INK4a 疫苗、融合蛋白疫苗和細胞疫苗等。

5.2 HPV 疫苗的現(xiàn)況 目前，應用較為廣泛的HPV疫苗主要是預防性疫苗，主要有2種[33]：一種是美國默克公司生產(chǎn)的針對HPV 6型、11型、16型、18型的四價疫苗Gardasil，另一種是葛蘭素史克公司生產(chǎn)的針對16型和18型二價體疫苗Cervarix，二者分別于2006年6月和2009年10月通過美國FDA的批準。疫苗最佳注射時間是在首次性生活之前，兩種疫苗最早可接種年齡為9歲，疫苗的有效期在5年以上，臨床試驗結果證明其均有良好的耐受性，且沒有嚴重的不良反應，抗體效價比自然感染HPV的患者高50倍[34，35]。

5.3 HPV 疫苗存在的問題及展望近幾十年來，人們在宮頸癌發(fā)病機制以及宮頸癌預防和治療方面取得了很大的進展，HPV 疫苗的發(fā)明為通過接種預防宮頸癌提供了可能。預防性HPV 疫苗Gardasil和Cervarix 在一些國家和地區(qū)得到了較為廣泛的應用，但在某些國家和地區(qū)針對是否將其納入常規(guī)接種計劃尚有爭議。預防性HPV 疫苗在預防HPV 感染和CIN 方面有高效性，在安全性方面在一定程度上也可得到保證。但HPV 預防性疫苗只能預防疫苗亞型范圍內的HPV 感染，對疫苗范圍外的亞型感染沒有保護作用，對已經(jīng)感染此種HPV 亞型的女性也沒有保護作用。在我們國家，宮頸癌的發(fā)生率相對較高,引起宮頸癌最常見的高危亞型是52、58型，目前國際上市的兩種HPV 疫苗均未針對其，因此相應的HPV 疫苗也沒有在國內上市，我們仍然需要通過篩查來盡早發(fā)現(xiàn)宮頸病變。盡管目前疫苗存在一些問題，但是隨著該領域研究的發(fā)展，問題終將得到解決。

綜上所述，HPV與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、預防和治療都有密不可分的關系。針對目前研究中存在的問題，我們應進一步加強對HPV 感染與宮頸癌關系的研究，研制出針對性的人乳頭狀瘤病毒疫苗，使人類最終免受宮頸癌及其它HPV 相關疾病的危害。

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