反相高效液相色譜法測定黃酒中的草酸

譚新勇，孫軍勇，謝廣發(fā)，陸 健*

（1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；4.中國紹興黃酒集團有限公司 國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000）

黃酒是我國的國粹，酒香濃郁，營養(yǎng)豐富，具有很高的營養(yǎng)價值和保健功效，深受人們喜愛[1]。目前我國黃酒行業(yè)呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢，消費量逐漸增大，年出口量也日益增多，但黃酒的非生物渾濁一直是困擾企業(yè)的難題，黃酒儲存過程中的沉淀問題還有待徹底解決，在實際生產(chǎn)過程中，發(fā)現(xiàn)黃酒沉淀中還存在著草酸鹽沉淀組分[2]，在草酸含量高的成品酒瓶底會出現(xiàn)草酸鹽沉淀。草酸在食品中是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，在日常飲食中如果草酸含量過高，會導(dǎo)致草酸和鈣離子結(jié)合形成草酸鈣沉淀甚至導(dǎo)致結(jié)石癥，對人的身體健康造成重要影響，人的尿液中草酸含量的高低是診斷結(jié)石病的一個重要指標(biāo)[3]。黃酒的草酸鹽沉淀一直困擾著黃酒企業(yè)，一旦出現(xiàn)沉淀，企業(yè)就要召回產(chǎn)品，這對企業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。為解決黃酒出現(xiàn)的草酸鈣沉淀問題，就需要建立合適的檢測黃酒原料和生產(chǎn)工藝過程中草酸含量的方法。

目前黃酒行業(yè)并沒有較好的方法來測定黃酒中的草酸含量[4]，雖然檢測食品中有機酸的方法很多[5-11]，但各有優(yōu)缺點。分光光度法分辨率低，靈敏度差，易受其他物質(zhì)干擾，檢測誤差較大[5-6]，而且黃酒顏色較深，比色效果不明顯；用色譜法分析釀造酒中有機酸的報道很多[7-9]，氣相色譜要求酸有較高的揮發(fā)性，但草酸沸點較高、揮發(fā)性弱，不適合用氣相色譜檢測；反相高效液相色譜是應(yīng)用最廣泛的液相色譜法[8-9]，在食品、生物分析、醫(yī)藥等領(lǐng)域均有重要作用，但在檢測過程中，草酸與酒石酸的分離度較低，導(dǎo)致兩峰檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[12]。

本研究以鄰苯二胺為衍生劑，與草酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)。鄰苯二胺與草酸的2個羧基在高溫作用下發(fā)生特定反應(yīng)，生成化合物——2，3-二羥基喹喔啉[13]，其是強紫外吸收化合物，在波長314nm處有最大吸收峰，可以被檢測器靈敏檢測到[14-15]。在國外，將鄰苯二胺與草酸衍生后測定其含量的方法已經(jīng)應(yīng)用于啤酒和蔬菜中草酸含量的測定，結(jié)果滿足檢測要求[13]。2，3-二羥基喹喔啉的吸收峰能夠與雜峰很好分離，而且解決了草酸與酒石酸分離度較低的問題。在此基礎(chǔ)上研究了最佳的色譜分離條件，優(yōu)化了流動相配比和流速，測定了衍生物的穩(wěn)定性，進(jìn)行了精密度實驗和回收率實驗，取得較滿意結(jié)果，證明本方法可應(yīng)用于黃酒中草酸含量的測定。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

戴安Ultimate3000液相系統(tǒng)、色譜柱（Dionex Acclaim 120 C184.6×250mm 5μm）：美國戴安公司；Aglient Zorbax SB-Aq 4.6×150mm 5μm，Aglient extent-C184.6×250mm 5μm，美國安捷倫公司；Sunfire 4.6×250mm 5μm，美國Waters公司；AP-01P型無油隔膜真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；PE20精密pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QT-1渦旋混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Heraeus Fresco 17離心機，德國Thermo scientific公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 主要試劑及實驗材料

草酸（含2個結(jié)晶水）、鄰苯二胺、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸銨為分析純，甲醇為色譜純，均購于國藥集團藥業(yè)股份有限公司；黃酒為無錫本地市售產(chǎn)品，某黃酒企業(yè)提供不同批次的酒樣。

1.3 實驗方法

1.3.1 草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的配置

準(zhǔn)確稱取0.07g草酸置于500mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，配置成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃冰箱中備用。

1.3.2 流動相的配置

準(zhǔn)確稱取7.71g乙酸銨置于1000mL容量瓶中，定容后以甲醇:乙酸銨溶液=15:85的比例加入甲醇，混勻后經(jīng)0.45μm混合纖維濾膜抽真空過濾，超聲波脫氣30min后使用。

1.3.3 衍生

按照參考文獻(xiàn)[13]的方法，將草酸標(biāo)樣或黃酒樣品用10mol/L鹽酸酸化至pH=1.0后，取5mL樣品置于20mL螺口玻璃離心管中，加入10μL鹽酸（10mol/L）和2mL鄰苯二胺溶液（10g/L），混勻后稱重，在110℃烘箱中保溫6h，室溫冷卻后添加雙蒸水恢復(fù)至原來重量，用10mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0～6.0，并2000r/min離心10min，最后樣品用0.45μm混合纖維濾膜過濾，轉(zhuǎn)移到液相樣品瓶中即可進(jìn)行色譜分析，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為50μL。

1.3.4 草酸定性定量方法

通過測定標(biāo)樣的保留時間、樣品加標(biāo)定性。將草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后進(jìn)行處理，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積外標(biāo)法定量。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同色譜柱分離效果的比較

本實驗利用4根不同的反相高效液相色譜柱，在不同條件下對衍生物進(jìn)行分離，由于黃酒樣品色譜峰較多，對分離要求高，最終選擇了分離效果好、目的峰明確的Dionex Acclaim 120 C18色譜柱。

2.2 流動相中甲醇比例對分離效果的影響

流動相中選擇甲醇含量為10%vol、15%vol、20%vol，考察其對分離效果的影響，見圖1。當(dāng)甲醇含量為10%vol時，目的峰保留時間為20.25min，分離時間長。隨著甲醇含量的增加，出峰時間逐漸靠前，當(dāng)甲醇含量為20%vol時，目的峰保留時間為8.25min，此時出峰時間集中，分離度較低。當(dāng)甲醇含量為15%vol時，目的峰保留時間為10.68min，黃酒樣品中目的峰能與其他峰分開，出峰時間較適宜，因此最終選擇甲醇比例為15%vol。

圖1 流動相中不同比例甲醇對標(biāo)樣分離效果的影響Fig.1 The effects of different proportion of methanol in mobile phase on standard separation

2.3 流動相流速對分離效果的影響

分別選擇流動相流速為0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min進(jìn)行實驗，檢測對分離效果的影響。結(jié)果表明，流速對分離效果的影響較小，但流速低會導(dǎo)致分離時間長，峰型欠佳，分離效果差，應(yīng)當(dāng)選擇高流速，但由于色譜柱自身柱壓的限制，流速只能達(dá)到1.2mL/min，最終確定流速為1.2mL/min，在此流速條件下，分離度能達(dá)到理想效果，目的峰能與其他峰分離，峰形較好，響應(yīng)值也較高。

2.4 衍生物穩(wěn)定性的測定

由于一般衍生物的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，2，3-二羥基喹喔啉是首次應(yīng)用于黃酒中，因此需要對2，3-二羥基喹喔啉的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。取衍生好的樣品，每隔1h測定樣品中2，3-二羥基喹喔啉的含量，與第一次測定結(jié)果的比值表示測定的相對含量，連續(xù)測定7h，獲得的結(jié)果見圖2。由圖可知，在前3h內(nèi)衍生物的相對含量值均在0.95以上，因此可以確定衍生結(jié)束后3h內(nèi)為測定的最佳時間。

圖2 衍生物相對含量隨時間變化圖Fig.2 The change of relative content of derivatives with time

2.5 草酸標(biāo)樣和黃酒樣品的色譜分離圖

綜上所述，黃酒中草酸檢測的最優(yōu)條件為色譜柱：Dionex Acclaim 120 C18柱；流動相甲醇：0.1mol/L乙酸銨=15:85（v/v）；流速1.2mL/min；柱溫25℃；檢測波長314nm；進(jìn)樣量50μL；在3h以內(nèi)進(jìn)行測定。應(yīng)用優(yōu)化后的條件，對草酸標(biāo)樣和黃酒樣品進(jìn)行衍生測定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，黃酒中草酸衍生物分離效果好，能夠達(dá)到基線分離，無明顯雜峰干擾。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及線性范圍的確定

分別取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加雙蒸水到5mL，然后按照樣品處理方法，經(jīng)衍生后進(jìn)行色譜分析，以峰面積定量，得到草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.9772x-3.503，R2=0.9986。結(jié)果表明草酸濃度在20mg/L～100mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度和回收率實驗

按照檢測方法，對樣品進(jìn)行重復(fù)性實驗（n=5），進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果見表1，在多次測定的樣品中，測定重現(xiàn)性均較好。選擇3種酒樣，分別取5mL黃酒為酒基，各添加2.0g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL、100μL、200μL，配置成加標(biāo)量分別為20mg/L、40mg/L、80mg/L的樣品，經(jīng)過衍生后進(jìn)行檢測，計算得平均回收率見表2。

圖3 標(biāo)樣（A）和黃酒（B）中草酸衍生物的檢測Fig.3 The detection of oxalic acid derivative on standard(A) and rice wine(B)

圖4 草酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.4 Standard working curve of oxalic acid

表1 草酸含量的精密度實驗（n=5）Table 1 The precision experiments of oxalic acid content (n=5)

從表1可以看出，對于草酸含量不同的樣品，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.67%～9.30%，精密度較好，說明本方法的重現(xiàn)性較好，適合測定黃酒中的草酸含量。從表2可以看出，在樣品中添加不同量的草酸標(biāo)樣，其回收率在91.40%～103.70%，說明該方法準(zhǔn)確性好，可以保證測定結(jié)果的可靠性。

表2 草酸含量的回收率實驗（n=3）Table 2 The recovery experiments of oxalic acid content (n=3)

2.8 市售黃酒中草酸含量的測定

對市售黃酒中草酸含量進(jìn)行測定，得到黃酒中草酸含量最低為13.03mg/L，最高為57.97mg/L，平均草酸含量為40.55mg/L，不同品牌的黃酒中草酸含量差異很大。對于同一黃酒企業(yè)中的不同酒樣進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)機制加飯酒中草酸含量高于手工加飯酒，可能與黃酒釀造使用的原料、生產(chǎn)工藝及儲存環(huán)境有關(guān)。

3 結(jié)論

建立了一種先衍生，然后利用反相高效液相色譜法檢測黃酒中草酸含量的方法，最優(yōu)檢測條件為色譜柱：Dionex Acclaim 120 C18柱（4.6×250 mm，5μm）；流動相為甲醇和0.1mol/L乙酸銨（15:85 v/v）；流速1.2mL/min；柱溫25℃；檢測波長314nm。該方法檢測簡便，線性關(guān)系良好，重現(xiàn)性好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜9.30%，回收率高，平均回收率為91.40%～103.70%。測得不同品牌黃酒中草酸含量有一定差異，最低值為13.03mg/L，最高值為57.97mg/L。而且機制加飯酒中草酸含量要高于手工加飯酒。差異可能與使用原料、生產(chǎn)工藝及儲存時間、環(huán)境有關(guān)。研究結(jié)果對于研究黃酒發(fā)酵過程中草酸含量變化、控制黃酒中草酸含量、減少草酸鈣沉淀的產(chǎn)生有一定的指導(dǎo)意義。

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