三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生防菌綠色木霉的初步研究

王君君，譚顯東*，羊依金，楊如勇，孫 楠

（成都信息工程學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610225）

目前，木霉在生防上的應(yīng)用主要為孢子制劑，木霉制劑可以用于葉面噴灑，種子處理，還可以使用到土壤中，對作物根系、種子以及幼苗都起到保護(hù)作用[1]。綠色木霉（Trichodermaviride）是一種重要的生防菌，主要是通過競爭、重寄生、產(chǎn)生抗生素、誘導(dǎo)抗性、溶菌、植物促生等多種機(jī)制實現(xiàn)對病原真菌的拮抗作用[2]。作為生防劑的木霉菌生產(chǎn)方法所采用的培養(yǎng)基大多以糧食為主[3-4]，生產(chǎn)成本較高，限制了其大范圍的應(yīng)用。為了在低成本的前提下獲得高的產(chǎn)孢量，許多研究者摸索了各種培養(yǎng)條件。其中包括用玉米粉[5]、植物秸稈和麥麩等進(jìn)行液態(tài)和固體發(fā)酵培養(yǎng)[6]。中成藥在生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的藥渣，如果長期堆置不處理極易腐壞，其味臭難聞，在夏季更為嚴(yán)重，對環(huán)境也造成了極大的污染。中藥渣中含有大量的淀粉、多糖、粗脂肪、粗蛋白、粗纖維及大量的氨基酸、維生素和微量元素[7]。將中藥渣作為發(fā)酵基質(zhì)使用，不僅能變廢為寶，提高植物資源的利用率，而且對消除環(huán)境污染也具有重要的意義。本試驗以三七渣為培養(yǎng)基質(zhì)，通過單因素和正交試驗篩選出最佳的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，為三七渣大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉提供參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌種：綠色木霉3.3711菌株由四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院保藏和提供。

三七渣：取自成都某制藥廠，濕物料經(jīng)烘干、粉碎、過篩后置于干燥器中備用。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液1.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，pH值自然，121℃滅菌30min，用于綠色木霉的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將滅菌的PDA培養(yǎng)基冷卻至45℃，倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，冷卻至室溫后接種綠色木霉，30℃培養(yǎng)3d。

1.2.2 發(fā)酵方法及產(chǎn)孢量測定

三七渣10g含水量60%攪拌均勻，裝入250mL三角瓶中封口滅菌，活化后的綠色木霉菌株用無菌水配制成孢子懸浮液（2×107cfu/mL）。將孢懸液接入三七渣培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)5d。發(fā)酵后取1g發(fā)酵物，0.1%吐溫水稀釋，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?，血球計?shù)板測定孢子濃度[8]。

初始含水量計算公式：

注：M1為三七渣質(zhì)量，g；M2為加營養(yǎng)液后的總質(zhì)量，g。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗

分別考察氮源添加量、pH值、粒徑、磷酸鹽添加量、含水量、麩皮添加量對產(chǎn)孢量的影響。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗

以產(chǎn)孢量為考察指標(biāo)，取氮源添加量、含水量、磷酸鹽添加量3個因素，每因素設(shè)3個水平。

1.2.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 氮源添加量對產(chǎn)孢量的影響

氮是合成蛋白質(zhì)的重要元素，是微生物細(xì)胞生長和代謝的重要成分，三七渣中氮源相對缺乏，碳氮比不能滿足微生物生長的需求，所以需要適當(dāng)?shù)难a充氮源。由圖1可見，適當(dāng)添加氮源能增加產(chǎn)孢量。在氮源添加2%時產(chǎn)孢量最高，氮源添加過高或過低都對產(chǎn)孢不利；氮源不足時，碳氮比失調(diào)，菌體生長繁殖緩慢，不利于產(chǎn)孢；氮源過高時，不僅會造成氮源浪費，而且會抑制微生物的生長。

圖1 氮源添加量對產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effect of addition of nitrogen source on sporulation quantity

2.1.2 初始pH值對產(chǎn)孢量的影響

圖2 初始pH值對產(chǎn)孢量的影響Fig.2 Effect of initial pH value on sporulation quantity

大多營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與H+存在協(xié)同運輸作用[9]，所以菌種需要在適宜的pH值范圍內(nèi)才能較好的生長。有研究表明多數(shù)真菌對環(huán)境pH值不是很敏感，一般在3～9都能很好的生長[10]，略偏酸性環(huán)境適宜木霉的生長，當(dāng)pH值過高或過低時，木霉生物量才有所降低[11]。由圖2可見，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在3～8時，綠色木霉產(chǎn)孢量變化不大，尤其pH值為5～8時，產(chǎn)孢量基本不變。分析其原因可能是綠色木霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一些代謝物來調(diào)節(jié)其生長環(huán)境的pH值；同時三七渣本身也具有一定的緩沖能力。三七渣培養(yǎng)基自然pH值為6左右，故后續(xù)試驗中將采取自然pH值。

2.1.3 原料粒徑對產(chǎn)孢量的影響

圖3 原料粒徑對產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effect of particle size of raw materials on sporulation quantity

由圖3可見，原料粒徑在100目時發(fā)酵效果較好，隨著粒徑的減小產(chǎn)孢量降低。因為粒徑太小容易造成發(fā)酵底物的積團(tuán)，顆粒間空隙減小，導(dǎo)致阻力增大，不利于系統(tǒng)的傳熱、傳質(zhì)，進(jìn)而影響微生物的呼吸，使其不能良好的生長[12]。

2.1.4 磷酸鹽添加量對產(chǎn)孢量的影響

圖4 磷酸鹽添加量對產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effect of addition of phosphate on sporulation quantity

磷是構(gòu)成菌體核酸、核蛋白等細(xì)胞物質(zhì)的重要組成成分，也是很多輔酶和高能磷酸鍵的構(gòu)成成分[13]，同時又是氧化磷酸化反應(yīng)的必需元素，鉀在酶反應(yīng)中作為激活劑或輔助因子[14]，因此，磷和鉀的添加對微生物的生長有很大的影響，磷酸鹽對菌體的基礎(chǔ)代謝及代謝產(chǎn)物的合成有促進(jìn)作用，其中磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀這兩種磷酸鹽既是良好的磷源和鉀源[15]，又是重要的緩沖劑[13]。在固體培養(yǎng)基中添加一定量的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，2種磷酸鹽的比例為5:4，考察其對產(chǎn)孢量的影響，由圖4可見，磷酸鹽在0.45%和2.25%時都出現(xiàn)峰值，王永東等[15]研究也出現(xiàn)這種現(xiàn)象。研究結(jié)果表明，磷酸鹽添加2.25%時綠色木霉產(chǎn)孢量最大。

2.1.5 含水量對產(chǎn)孢量的影響

由圖5可見，當(dāng)含水量為70%時產(chǎn)孢量最高。在最適含水量下，培養(yǎng)基疏松度較好，培養(yǎng)基的顆粒之間存在合適的空隙，利于氧氣的溶入和二氧化碳的排出，有利于菌體生長繁殖，從而增加產(chǎn)孢量；當(dāng)含水量過低時，不能保持菌體的生長特性，引起細(xì)胞新陳代謝不平衡，影響產(chǎn)孢量；當(dāng)含水量過高時，物料易結(jié)塊成團(tuán)，多孔性降低，減少了物料內(nèi)的氣體交換[13]，菌絲只在基質(zhì)表面生長，培養(yǎng)基的透氣性大大降低，難以通風(fēng)和散熱，也不利于微生物的生長，同時觀察發(fā)酵底物內(nèi)部，散發(fā)出一種腐敗味。

圖5 含水量對產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effect of moisture content on sporulation quantity

2.1.6 麩皮添加量對產(chǎn)孢量的影響

圖6 麩皮添加量對產(chǎn)孢量的影響Fig.6 Effect of addition of bran on sporulation quantity

麩皮中含有一定量的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和無機(jī)鹽，可以促進(jìn)微生物生長和繁殖，同時麩皮質(zhì)地疏松能增大底物的間隙率，有利于傳質(zhì)、傳熱，對微生物的通氣和呼吸有促進(jìn)作用[16]。由圖6可見，隨著麩皮添加量的增大，產(chǎn)孢量也逐步提高，麩皮在固態(tài)發(fā)酵過程中起到明顯的促進(jìn)作用；但從相對增加孢子量來看，麩皮添加10%時相對增加的孢子量最大，而且過多的添加麩皮會對主原料的研究意義降低，因此選擇10%的麩皮添加量。

2.2 三七渣固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

通過對單因素培養(yǎng)基組分的篩選，氮源添加量、含水量、磷酸鹽添加量3個因素對三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉的產(chǎn)孢量影響較大，本研究采用L9（33）正交試驗對培養(yǎng)基制備條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果與方差分析分別見表2和表3。

方差分析結(jié)果表明，氮源添加量、含水量以及所考察的3個因素之間的交互作用對試驗結(jié)果的影響極顯著（p<0.01），磷酸鹽添加量對試驗結(jié)果的影響顯著（p<0.05），由于所考察的3個因素之間的交互作用顯著，需要進(jìn)行多重比較才能獲得最優(yōu)的試驗條件搭配。正交試驗結(jié)果的多重比較分析見表4。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素水平Table 1 Levels and factors of orthogonal test of fermentation condition optimization

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test of fermentation conditions optimization

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

表4 正交試驗多重比較Table 4 Multiple comparation of orthogonal test

由表4可以看出，2號試驗和5號試驗的結(jié)果沒有顯著差異，其試驗結(jié)果顯著優(yōu)于其他試驗。2號實驗的結(jié)果略好于5號試驗，因此，在所考察的3個試驗因素中，最佳的搭配是A1B2C2，即硫酸銨添加量為1%，含水量為60%，磷酸鹽添加量為1.35%。在此條件下，綠色木霉的產(chǎn)孢量為8.59×109cfu/g。據(jù)報道，木霉孢子制劑的孢子濃度達(dá)到105cfu/g時，對一些植物真菌病害有明顯的防治效果[17]，而本研究所獲得的三七渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中綠色木霉孢子濃度可達(dá)到109cfu/g，因此，該產(chǎn)品具有較高的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

以三七渣為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生防菌綠色木霉是可行的，其優(yōu)化的培養(yǎng)基制備條件為麩皮添加量為10%，硫酸銨添加量為1%，含水量為60%，磷酸鹽添加量為1.35%，原料粒徑100目，pH值自然。在此條件下發(fā)酵，綠色木霉產(chǎn)孢量可達(dá)到8.59×109cfu/g。

[1]HARMANGE,TAYLOY A G,STASZ T E.Combining effectivestrains ofTrichoderma harzianumand solid matrix priming to improve biological seed treatments[J].Plant Dis,1989,73(8):631-637.

[2]屈海泳，劉連妹，王雪梅.木霉菌在生物防治上應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：743-746.

[3]王漢榮，茹水江，王連平.木霉屬真菌生防顆粒菌劑及其制備方法[P].中國，CN1554242A，2004.

[4]王寬倉，查仙芳，等.用于植物土傳性病根防治的木霉菌菌株及其發(fā)酵、粉粒劑制備工藝[P].中國，CN1422946A，2003.

[5]劉時輪，李 勇，傅俊范，等.綠色木霉菌株Tv04-2固體發(fā)酵條件研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2008（S2）：244-247.

[6]張 良，紀(jì)明山，張玉芬，等.綠色木霉TR-8發(fā)酵工藝條件篩選[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005（4）：494-496.

[7]馬遜風(fēng)，馬宏軍，唐占輝，等.中藥渣剩余成分分析及利用途徑研究[J].東北師大學(xué)報：自然科學(xué)版，2004（2）：108-111.

[8]陳 欣，李 寅，堵國成，等.應(yīng)用響應(yīng)面方法優(yōu)化Coniothyrium minitans固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物農(nóng)藥[J].工業(yè)微生物，2004（1）：26-29.

[9]劉 梅，徐 同.木霉的營養(yǎng)生長及發(fā)酵條件[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，15（3）：263-268，278.

[10]陳洪章.纖維素生物技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[11]于敏敏，王守娟，劉 鵬，等.木霉T68發(fā)酵基質(zhì)的研究[J].中國釀造，2011（3）：31-35.

[12]劉鳳梅，譚顯東，羊依金，等.三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料[J].中國釀造，2011，227（2）：67-70.

[13]張福元，陳風(fēng)風(fēng).混菌發(fā)酵酒糟飼料的初步研究[J].飼料研究，2008（11）：32-34.

[14]楊振海，蔡輝益.飼料添加劑安全使用規(guī)范[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[15]王永東，蔣立科，岳永德，等.生防菌株哈茨木霉H-13固體發(fā)酵條件的研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2006，32（6）：645-650.

[16]朱 輝，婁沂春，林福呈，等.利用城市垃圾發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉孢子[J].微生物學(xué)通報，1999（6）：387-389.

[17]HARMAN G E,CHET I,BAKER R.Factors affectingTrichoderma hamatumapplied to seeds as a biocontrol agent[J].Phytopathology,1981,71:569-572.