酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)研究方法綜述

史 瑩，楊 敏，梁 琪，* ，喬海軍，張衛(wèi)兵

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070;3.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070)

牛乳蛋白質(zhì)通常分為酪蛋白(casein，CN)和乳清蛋白，各自含量約占乳中總蛋白的80%和20%，依品種不同有變化;酪蛋白是乳中一大類蛋白質(zhì)的總稱，是乳中主要的蛋白質(zhì)成分，由 αs1-、αs2-、β-、κ-CN四部分組成，質(zhì)量比大約為 4∶1∶4∶1 左右，平均等電點(diǎn)在4.8;四種單體可以通過(guò)在水相中疏水作用和靜電排斥作用的平衡形成CN膠束［1-2］。常乳中大約80%～95%的CN以膠體分散粒子的形式存在，稱為膠束，其中包含94%的蛋白質(zhì)干基和6%的膠體磷酸鈣［3］。CN被廣泛用在食品、化妝品和一些其他的日常用品中，因此CN膠束的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)被大量研究。掃描電鏡、透射電鏡、電泳、反相高效液相色譜、動(dòng)態(tài)光散射、超聲波光譜、紫外-可見分光光度計(jì)等技術(shù)廣泛用于CN膠束結(jié)構(gòu)的研究中。

1 酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的研究方法

1.1 內(nèi)部結(jié)構(gòu)

CN膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu)至今無(wú)法觀察，許多學(xué)者提出了各種理論模型，以下三種模型被廣泛接受:亞單元模型，該模型認(rèn)為，15～20個(gè)CN單體分子通過(guò)疏水相互作用組成一個(gè)個(gè)亞單元，根據(jù)κ-CN的含量又分為富含和少量的κ-CN亞單元，亞單元和磷酸鈣連接形成 CN膠束;內(nèi)部結(jié)構(gòu)模型，認(rèn)為 αs1-、αs2-、β-CN位于膠束的核心，κ-CN位于膠束的表面，起保護(hù)作用;微簇結(jié)構(gòu)模型，認(rèn)為CN分子與磷酸鈣纏繞在一起，磷酸鈣分布在膠粒的內(nèi)部，κ-CN在膠束表面形成毛發(fā)層結(jié)構(gòu)為膠束提供靜電相互作用或電荷，維持CN粒子的穩(wěn)定性［4-7］。微簇結(jié)構(gòu)模型在2003年提出后被廣泛接受。

1.2 表面結(jié)構(gòu)研究方法

CN膠束表面接近球形并且不光滑，在亞結(jié)構(gòu)之間存在間隙［5］。膠束表面κ-CN的分布不均勻，從表面突起并自然延伸，直徑大約在50～600nm，平均直徑在150nm［8］。對(duì)CN膠束表面結(jié)構(gòu)的研究主要通過(guò)掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡。

1.2.1 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)近年來(lái)，掃描電子顯微鏡觀察CN膠束的表觀結(jié)構(gòu)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，工作原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。該手段能觀察CN膠束不光滑的表面并且能測(cè)定粒徑的大小。通過(guò)電子顯微鏡觀察CN膠束的形狀是球形，直徑在50～500nm之間［3］。

普通的SEM分辨率比較低，不能清楚地描述表面結(jié)構(gòu)，觀察到的CN膠束是球形。而近幾年通過(guò)高分辨率的掃描電鏡觀察到是近球形，比普通膠束更大，直徑在300～350nm之間，CN膠束的表面比簡(jiǎn)單的由相對(duì)較短的毛發(fā)覆蓋的硬球體更加復(fù)雜。CN膠束結(jié)構(gòu)比簡(jiǎn)單的球形模型有更多的“面”，表面相當(dāng)不規(guī)則，表面積比球形大。一些κ-CN只是管狀模型的終止，不需要均勻的覆蓋“球形的”表面，更接近CN的真實(shí)表面結(jié)構(gòu)［9］。

1.2.2 透射電子顯微鏡(transmissionelectron microscopy，TEM)透射電子顯微鏡的原理:由電子槍發(fā)射出來(lái)的電子束，在真空通道中通過(guò)聚光鏡將之匯聚成一束光斑，照射在樣品上，電子束攜帶樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，在熒光屏上成像。在低分辨率時(shí)不能提供有關(guān)結(jié)構(gòu)的信息，因此一些學(xué)者用冷凍透射電子顯微鏡(cryo-TEM)和高分辨率的TEM觀察CN膠束的結(jié)構(gòu)，成功地觀察到了脫脂乳的CN膠束結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CN膠束的表面結(jié)構(gòu)有點(diǎn)粗糙并且不規(guī)則，膠束的形狀沒有出現(xiàn)完全的球形［10］，并且有一個(gè)相當(dāng)不規(guī)則的外圍結(jié)構(gòu)，從表面上看，CN被組織成蛋白質(zhì)鏈相互糾纏的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)自然的延伸并在表面突出［11］。通過(guò)高分辨率的TEM觀察CN膠束的結(jié)構(gòu)，McMahon［12］等人提出了CN膠束的超分子結(jié)構(gòu)，盡管在CN膠束內(nèi)部允許相當(dāng)大的變化，但其仍是一個(gè)非常開放的結(jié)構(gòu)，通過(guò)磷酸鈣納米簇上的蛋白質(zhì)鏈的環(huán)環(huán)相扣來(lái)自我強(qiáng)化;在超分子矩陣結(jié)構(gòu)內(nèi)閉合的空間將由牛乳中溶解的乳糖、離子和其他可溶性物質(zhì)的乳清占據(jù)。由此可見，高分辨率和冷凍的TEM能夠成功的觀察CN膠束的表面結(jié)構(gòu)，且兩者都被許多學(xué)者廣泛應(yīng)用。

1.2.3 原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)原子力顯微鏡有一根納米級(jí)的探針，通過(guò)檢測(cè)樣品與探針之間的原子排斥力來(lái)反映樣品表面形貌和其他表面結(jié)構(gòu)，可以分辨出極小尺度上的表面細(xì)節(jié)和特征。通過(guò)該手段觀察發(fā)現(xiàn)，牛乳CN在高壓下，原始膠束的直徑減小，解離程度大于聚集程度［13］。在高壓下，CN表面形態(tài)相當(dāng)不均勻，復(fù)合物易碎，膠束連續(xù)不斷的分解，最終完全分解成單體［14］。

目前，酪蛋白膠束表面結(jié)構(gòu)常用的觀測(cè)手段為上述三種電子顯微鏡。SEM和TEM的前處理比較復(fù)雜，容易破壞CN膠束的結(jié)構(gòu);TEM對(duì)待測(cè)樣品有厚度和形態(tài)上的要求，并且要求在電子線照射下不損壞或發(fā)生變化;AFM避免了復(fù)雜的前處理以及電子束輻射損傷等的限制，具有很高的橫向分辨率和縱向分辨率［15］。將AFM和其他儀器結(jié)合起來(lái)，相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，在未來(lái)將會(huì)有更好的應(yīng)用前景。

2 酪蛋白膠束解離與聚集的測(cè)定方法

在酶、熱和高壓等各種外界因素的作用下，CN膠束的穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化。這些變化包括酶凝過(guò)程中的解離和聚集，蛋白質(zhì)水解、絮凝、凝膠作用和脫水收縮作用等［16］。酶促反應(yīng)過(guò)程中κ-CN的Met106鍵首先會(huì)發(fā)生水解，使CN膠束發(fā)生解離，生成兩種多肽:一種是N-末端的para-κ-CN，仍然和CN膠束連接著，而C-末端的多肽(糖巨肽)，被釋放到乳清相中［17］。這些變化都可通過(guò)電泳、反相-高效液相色譜、超聲波光譜、擴(kuò)散波光譜、動(dòng)態(tài)光散射、粒度儀和紫外分光光度計(jì)測(cè)定。這些方法又可分為直觀的測(cè)定和通過(guò)樣品溶液的理化指標(biāo)來(lái)測(cè)定兩種，其中電泳和反相高效液相色譜法可直觀測(cè)得CN膠束的解離;而其他幾種方法是通過(guò)測(cè)定溶液的指標(biāo)來(lái)說(shuō)明膠束的解離與聚集。

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，組成CN膠束的單體分子量和電荷不同，根據(jù)解離程度，溶液中的單體含量在改變，電泳可分析這四種單體的變化，因此可將其分離。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和光密度計(jì)連接后，可成功分析凝乳酶作用脫脂乳過(guò)程中κ-CN的水解，κ-CN的水解和para-κ-CN的合成是同時(shí)進(jìn)行的，兩者之間的關(guān)系呈線性負(fù)相關(guān)［17］。這些結(jié)果表明SDS-PAGE能用來(lái)檢測(cè)酶解脫脂乳中的κ-CN。采用Urea-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，CN的水解過(guò)程中，γ-CN、β-CN的水解產(chǎn)物增加。研究表明，CN被水解成各個(gè)單體:γ1-、γ2-、γ3-、β-、αs1-CN、蛋白眎、蛋白胨;β-CN被逐步水解并在24h內(nèi)完全水解［18］。Urea-PAGE圖能很清晰的展示纖溶酶處理的脫脂乳中β-CN的大量水解。根據(jù)SDS-PAGE電泳條帶的強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，酶交聯(lián)的β-CN在酸性條件下具有較高的穩(wěn)定性，能抵抗胃蛋白酶的消化［19］。上述這些研究結(jié)果可以充分地表明電泳方法可以成功的用來(lái)分析CN的水解。然而，通過(guò)電泳分析只能定性說(shuō)明膠束解離與聚集的過(guò)程。

2.2 反相高效液相色譜法(reversed－phase highperformance liquid chromatographic，RP－HPLC)

反相高效液相色譜法，一般用非極性固定相，流動(dòng)相為水或緩沖液。CN在解離或聚集的過(guò)程中，通過(guò)RP-HPLC可以測(cè)得單體的含量，進(jìn)行定量說(shuō)明。Thoma［20］等人通過(guò)RP-HPLC方法定量的測(cè)定了CN的水解產(chǎn)物糖基化巨肽和非糖基化巨肽，發(fā)現(xiàn)此方法的準(zhǔn)確度和精密度都很好。Aline［21］等人用RP-HPLC分離CN和它們的脫磷酸產(chǎn)物，通過(guò)峰的保留時(shí)間對(duì)各個(gè)單體的分離以及脫磷酸產(chǎn)物成功地進(jìn)行了確定。

電泳和液相色譜法是測(cè)定CN膠束解離的兩種常見方法，樣品處理都相對(duì)簡(jiǎn)單，干擾小、進(jìn)樣量少、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，是直觀測(cè)定CN膠束解離的手段，快速、準(zhǔn)確。

2.3 超聲波光譜法(ultrasonic spectroscopy)

超聲波光譜法通過(guò)測(cè)定溶液的粒徑來(lái)動(dòng)態(tài)觀察CN膠束的解離與聚集，通過(guò)測(cè)定超聲速率和衰減量的變化來(lái)表征CN膠束的解離與聚集。傳統(tǒng)的超聲波有分辨率限制，超聲波速率的最高分辨率是0.1m/s，不能測(cè)量凝膠過(guò)程。最新引進(jìn)的高分辨率的超聲波光譜能使超聲速率測(cè)量有更高的分辨率，可達(dá)0.2mm/s。

用超聲波光譜法可以研究酶凝、酸凝和乳清蛋白的熱凝膠系統(tǒng)，超聲波實(shí)驗(yàn)可以證明凝膠的出現(xiàn)、明確反應(yīng)的不同階段，但不能詳細(xì)的說(shuō)明其中細(xì)節(jié)［22］。超聲波光譜可以和流變學(xué)結(jié)合使用，更加有利于對(duì)酪蛋白解離或聚集細(xì)節(jié)的研究。Wang［23］對(duì)比超聲波和振蕩流變學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，通過(guò)超聲波的方法測(cè)量CN酶法水解和聚集過(guò)程效果更為明顯，但對(duì)CN凝膠的形成不敏感。通過(guò)高分辨率的超聲波光譜和動(dòng)態(tài)流變學(xué)、近紅外透射結(jié)合分析酶凝過(guò)程中牛乳微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于κ-CN“毛發(fā)層”水解膠束聚合成的簇，膠束的平均粒徑降低然后形成凝膠結(jié)構(gòu)，超聲波對(duì)聚合物的散射能很好的描述酶凝過(guò)程中超聲衰減的變化［24］。高分辨率的超聲波光譜能低強(qiáng)度、無(wú)損的分析牛乳形成的凝膠微觀進(jìn)程的細(xì)節(jié)，必將有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 擴(kuò)散波光譜(diffusing wave spectroscopy，DWS)

擴(kuò)散波光譜可以檢測(cè)酶凝過(guò)程中CN膠束大小的改變，以此來(lái)分析CN膠束的聚集。DWS對(duì)粒徑大小的變化很敏感，能夠用來(lái)檢測(cè)粒徑大小的變化及 CN 膠束的聚集［25］。Alexander［26］等人通過(guò) DWS測(cè)粒徑大小，粒徑迅速增加能成功表征凝膠點(diǎn)，CN膠束半徑的小幅度減小是由于κ-CN毛層的坍塌和移除。此實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明DWS結(jié)果可以成功的分析CN膠束的解離與聚集。DWS還可以成功的觀察酶凝過(guò)程中表觀半徑和濁度的變化:酶凝過(guò)程中脫脂乳的濁度和表觀半徑都是增加的［27］。DWS還可以用于酸奶和干酪的加工中檢測(cè)CN膠束的聚集。DWS是一種較為先進(jìn)的方法。

2.5 動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)

近幾年光散射方法發(fā)展迅速，主要由于其對(duì)樣品是非侵入性的;簡(jiǎn)便、快捷;實(shí)驗(yàn)成本比較低;樣品不需要任何處理(除稀釋之外)。光散射需樣品滿足“單一散射原則”，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行高度稀釋［28］。章宇斌［29］等人用DLS測(cè)定了膠束尺寸并研究了CN膠束在各種因素下的聚集行為，熱處理導(dǎo)致流體力學(xué)半徑(Rh)不斷減小，Rh隨蛋白濃度和離子強(qiáng)度先減小后增大。Qi［30］等人通過(guò)DLS說(shuō)明蛋白酶加入后的0～120min，Rh增加;120～180min 時(shí)，Rh逐漸趨于穩(wěn)定，這些結(jié)果成功表明CN加入蛋白酶后發(fā)生聚集。粒徑大小或分布的改變能為膠束的聚集和解離提供有效信息，能幫助預(yù)測(cè)膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性和一系列宏觀性質(zhì)。不同因素影響下，CN膠束會(huì)發(fā)生不同程度的解離和聚集，DLS能快速、無(wú)創(chuàng)的測(cè)量CN膠束的粒徑。但是，通過(guò)DLS測(cè)粒度分布時(shí)，采用不同稀釋劑和不同溫度，粒度分布是不同的［31］。

2.6 粒度儀(Particle Size Analyser)

國(guó)外用DLS和DWS研究CN的較多，而用粒度儀測(cè)量CN膠束大小并不多見。McSweeney［32］等人通過(guò)馬爾文粒度分析儀測(cè)得模擬乳化液加熱之前pH在6.8時(shí)，粒徑分布在 10～100μm;pH6.9 時(shí)，1～10μm;pH≥7.0，粒度分布在＜1μm，此結(jié)果可以說(shuō)明調(diào)節(jié)pH可以增加CN膠束的穩(wěn)定性;粒度儀能成功測(cè)量CN膠束的粒徑。

粒度儀在測(cè)定CN膠束粒徑方面的報(bào)道比較少，激光光散射粒度儀報(bào)道相對(duì)較多，但是其原理和光散射原理一樣，這里不再介紹。光散射具有無(wú)損、無(wú)耗、快速、檢測(cè)溫度適宜、信息量多、操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)也很明顯，必須要對(duì)樣品進(jìn)行高度稀釋，這就限制了其應(yīng)用。而擴(kuò)散波光譜是一種無(wú)干擾、無(wú)侵入的光散射技術(shù)，不需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，適用于稠密的未稀釋樣品多重散射的光測(cè)量。

紫外可見分光光度法是通過(guò)測(cè)定溶液的濁度變化說(shuō)明CN膠束穩(wěn)定性的。

2.7 紫外可見分光光度計(jì)(UV－visible absorption spectroscopy)

由于各種物質(zhì)具有不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量也不盡相同，可根據(jù)吸收光譜判別物質(zhì)是否發(fā)生聚集和解離。在600nm下，用紫外可見分光光度計(jì)(UV-可見)測(cè)CN膠束溶液的吸光度，發(fā)現(xiàn)10℃和30℃CN聚集方式相似，但10℃時(shí)聚集速率慢［33］。Hidalgo［34］等人用 UV-可見說(shuō)明加熱使κ-CN穩(wěn)定性發(fā)生變化，并在聚集之前構(gòu)象發(fā)生改變或局部解離。

UV-可見是研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)相互作用的有效手段，具有靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。

3 展望

牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，CN是乳蛋白中一大類磷蛋白，近年來(lái)許多學(xué)者對(duì)CN膠束的結(jié)構(gòu)、影響因素、酸凝及酶凝機(jī)理等進(jìn)行了研究，但由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，至今為止，CN膠束的內(nèi)部詳細(xì)結(jié)構(gòu)尚不清楚，只提出了一些理論結(jié)構(gòu)模型，CN膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)的研究方法和手段是今后研究的重點(diǎn)，有待于學(xué)者深入探究。

研究CN膠束的解離與聚集的手段中，超聲波光譜和擴(kuò)散波光譜更先進(jìn)、無(wú)損，與傳統(tǒng)的方法相比，超聲波光譜可以低強(qiáng)度、無(wú)損的分析樣品，能透過(guò)光學(xué)上不透明的樣品，更適合牛乳系統(tǒng)的研究;擴(kuò)散波光譜適用于研究光學(xué)不透明稠密體系中凝固(膠凝)、聚合、絮凝和聚集過(guò)程，對(duì)粒徑的變化很敏感;紫外通過(guò)測(cè)溶液的濁度來(lái)分析樣品，快速、簡(jiǎn)便，而前處理較其他方法比較復(fù)雜，但由于儀器的價(jià)格較其他先進(jìn)儀器低廉，因此普及度高，應(yīng)用廣泛;超聲波光譜儀和擴(kuò)散波光譜儀價(jià)格昂貴，對(duì)于這兩種方法研究CN膠束的穩(wěn)定性在國(guó)內(nèi)罕見報(bào)道，因此應(yīng)用受到限制，但鑒于具有多種優(yōu)點(diǎn)，相信在以后的研究應(yīng)用中會(huì)越來(lái)越廣泛。

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