紫花苜蓿γ－生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶（γ－TMT）基因的克隆與逆境下的表達(dá)分析

賈會(huì)麗，王學(xué)敏，高洪文，董潔，王運(yùn)琦，劉建寧，石永紅

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原030032；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

＊維生素E是一種脂溶性維生素，在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化作用［1］。有資料研究表明，維生素E對(duì)提高動(dòng)物的免疫力，改善動(dòng)物肉質(zhì)，提高動(dòng)物繁殖性能，緩解動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)等具有良好的效果［2］。在飼料中添加生育酚，能增加肉品質(zhì)的穩(wěn)定性［3］，防止肉類腐敗、變味、變色，并延長上架時(shí)間［4，5］；醫(yī)學(xué)研究證明每天攝入足夠的維生素E會(huì)降低一些疾病的發(fā)生率，如心血管疾病、癌癥等，還有利于提高機(jī)體的免疫力等［6］。γ－生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶（γ－tocopherol methyltransferase）γ－TMT是維生素E合成途徑中一種重要的合成酶，催化γ－生育酚向α－生育酚的轉(zhuǎn)化，對(duì)于改變維生素E組成有重要作用。在擬南芥（Arabidopsisthaliana）葉片和種子中過量表達(dá)γ－TMT基因，使維生素E各成分中α－生育酚含量分別提高到90%和95%以上，維生素E活性提高10倍［7，8］。

維生素E還能參與清理植物體內(nèi)由于逆境脅迫產(chǎn)生的自由基，維持植物體內(nèi)抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡，提高植物的抗逆性［9］。在植物中，α－生育酚定位于質(zhì)體的內(nèi)膜、類囊體膜和微粒體膜等膜性結(jié)構(gòu)上，定位和結(jié)構(gòu)上的兩親性特點(diǎn)決定了植物體內(nèi)維生素E的主要功能與維持光合膜上ROS水平以及減輕膜脂過氧化程度有關(guān)［10，11］。據(jù)報(bào)道，逆境處理下，維生素E生物合成途徑中某些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)會(huì)被誘導(dǎo)，且不同的酶基因?qū)Σ煌拿{迫也會(huì)出現(xiàn)響應(yīng)時(shí)間以及響應(yīng)強(qiáng)度的差別［12］。對(duì)正常植株進(jìn)行逆境處理會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的增加，從而提高植株對(duì)自由基的清除能力［13］。有研究表明在輪葉黨參（Codonopsislanceolatae）中過量表達(dá)γ－TMT基因，能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化活性，且光合速率也比對(duì)照提高48%［14］。目前有關(guān)維生素E逆境脅迫方面的研究多集中在生育酚環(huán)化酶（tocopherol cyclase）TC、尿黑酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（homogentisate phytyltransferase）HPT和對(duì)羥苯丙酮酸雙加氧酶（4－Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）HPPD，而對(duì)γ－TMT的研究多集中在其生育酚合成方面，對(duì)其抗逆性的研究很少［15］。

紫花苜蓿（Medicagosativa）是目前全國乃至世界上種植最多的牧草，營養(yǎng)價(jià)值很高［16］，不論青飼、放牧或調(diào)制干草［17］，適口性均好，且具有抗寒、耐鹽堿等優(yōu)良特性［18，19］。因此，研究紫花苜蓿維生素E的合成途徑、克隆相關(guān)的酶基因，并通過生物技術(shù)方法增強(qiáng)植株的氧化活性、提高維生素E含量，對(duì)于提高紫花苜?？鼓嫘?，改善其營養(yǎng)品質(zhì)具有十分重要的意義。本研究從紫花苜蓿中克隆了Ms TMT的全長cDNA序列，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并通過模擬不同逆境（NaCl脅迫、PEG脅迫、黑暗脅迫、低溫脅迫以及ABA脅迫），對(duì)MsTMT基因的抗逆性進(jìn)行探討，為進(jìn)一步研究該基因的抗逆調(diào)控機(jī)制和紫花苜蓿的生育酚品質(zhì)改良打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用植物材料紫花苜蓿中苜1號(hào)（M.sativacv.Zhongmu No.1）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 2011年4月1日將中苜1號(hào)種子用氯氣消毒24 h后播種于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上，置于25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，待長出2片子葉后移至營養(yǎng)缽中（蛭石∶珍珠巖＝3∶1），培養(yǎng)4周取其葉片，用Trizol法提取總RNA，參照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。鹽、干旱和ABA處理時(shí)，植株分別用300 mmol／L NaCl、15%PEG和0.1 mmol／L ABA處理0，2，4，8，12和24 h；冷處理時(shí)，植株在4℃低溫下脅迫0，2，4，8，12和24 h；暗處理時(shí)，植株于黑暗下脅迫0，12，24，48和72 h，Trizol（Ta KaRa公司）法提取各種處理的幼苗葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；組織表達(dá)特異性分析時(shí)，在同一株紫花苜蓿上分別取根、莖、葉、花和莢果組織，Trizol法提取各組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上樣品保存于－70℃，用于后續(xù)Real－time PCR檢測。

1.2.2 紫花苜蓿γ－TMT基因保守區(qū)克隆 根據(jù)GenBank登記注冊(cè)的已有物種γ－TMT基因cDNA序列，Blast分析后得到其相對(duì)保守序列。再以蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）γ－TMT基因cDNA 序列為參照，結(jié)合NCBI上的Blast結(jié)果，用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)保守區(qū)特異性引物P1和P2（表1），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用DNA Gel Extract Kit（Fermentas公司，K0513）回收PCR產(chǎn)物，將回收片段連接PMD－18T載體（Ta KaRa公司，D101A），重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞（天根生化科技有限公司，CB101－01），挑選陽性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

表1 試驗(yàn)中所用到的引物序列Table 1 Sequence of primers used in the experiment

1.2.3 紫花苜蓿γ－TMT基因3′末端和5′末端cDNA片段的克隆 根據(jù)已獲得的紫花苜蓿γ－TMTcDNA保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)3′RACE特異性引物P3（表1）和5′RACE特異性引物P4（表1），按照SMARTTMRACE c DNA Amplification Kit（Clontech公司）的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，72℃3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃30 s，70℃30 s，72℃2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后72℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，進(jìn)行序列拼接，得到紫花苜蓿γ－TMT基因的全長序列。用DNAMAN 6.0軟件預(yù)測其可能的開放閱讀框（ORF），設(shè)計(jì)合成1對(duì)cDNA全長引物P5、P6（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物測序后得到紫花苜蓿γ－TMT基因ORF序列。

1.2.4 Real－time PCR檢測紫花苜蓿γ－TMT基因組織及逆境脅迫表達(dá)特異性 參照SYBR Premix Ex Taq（Ta KaRa公司，DRR041A）的引物設(shè)計(jì)原則，根據(jù)得到的紫花苜蓿ORF序列設(shè)計(jì)Real－time PCR特異性引物P7、P8（表1），預(yù)計(jì)片段大小為151 bp。選擇Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，用7500熒光定量PCR儀（ABI公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用2步法，條件如下：第1步，95℃預(yù)變性2 min，第2步，95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的周期閾值（cycle threshold），利用2－△△Ct方法［20］，分別計(jì)算紫花苜蓿γ－TMT基因在根、莖、葉、花、莢果中的表達(dá)量以及各逆境脅迫下的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿γ－TMT基因的克隆

根據(jù)NCBI上的Blast結(jié)果，用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物P1、P2，以紫花苜蓿cDNA為模板，擴(kuò)增得到404 bp的目的片段（圖1）。經(jīng)Blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)此片段與已報(bào)道的γ－TMT基因有較高的相似性，其中與截形苜蓿的γ－TMT基因cDNA序列同源性最高，為97%，初步確定獲得的cDNA片段是紫花苜蓿γ－TMT基因的部分片段。

根據(jù)得到的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)3′、5′RACE特異性引物，采用RACE技術(shù)結(jié)合PCR的方法，擴(kuò)增出γ－TMT基因的3′RACE和5′RACE末端序列，測序結(jié)果顯示3′和5′端的片段長度分別為660和743 bp（圖2）。用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行拼接，得到總長度為1 306 bp的全長c DNA序列。以紫花苜蓿cDNA為模板，用引物P5、P6擴(kuò)增得到939 bp的開放閱讀框（ORF）（圖3），該ORF序列與拼接獲得的ORF序列完全一致。

圖1 紫花苜蓿γ－TMT基因保守區(qū)擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of conservative fragment

圖2 紫花苜蓿γ－TMT基因3′RACE和5′RACE電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of the 3′RACE and 5′RACE fragments

2.2 紫花苜蓿γ－TMT基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAStar軟件對(duì)紫花苜蓿γ－TMT基因cDNA序列進(jìn)行分析，該基因全長1 306 bp，包含有一個(gè)939 bp完整的開放閱讀框，編碼312個(gè)氨基酸，命名為Ms TMT。氨基酸序列分析表明，Ms TMT基因編碼蛋白分子質(zhì)量約為34.5 k Da，理論等電點(diǎn)PI為5.62?？偣舶? 842個(gè)原子。在組成該酶的20種氨基酸中，堿性氨基酸（K、R）34個(gè)，酸性氨基酸（D、E）40個(gè)，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）118個(gè)，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）66個(gè)。

通過在線軟件http：／／prosite.expasy.org／cgi－bin／prosite／對(duì)Ms TMT進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因有1個(gè)腺苷脫氨基酶信號(hào)（［SA］－［LIVM］－［NGS］－［STA］－D－D－P）。利用NCBI的Blast P在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對(duì)Ms TMT進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測，結(jié)果顯示Ms TMT屬于甲基轉(zhuǎn)移酶家族（Ado Met－MTases）（圖4）。該蛋白還包含有2個(gè)S－腺苷甲硫氨酸的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（XXDXGCGIG，VXXPGGXXIX）（圖5），與大豆（Glycinemax）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）等其他物種的γ－TMT結(jié)構(gòu)相似［6，21，22］，表明該基因確實(shí)是紫花苜蓿γ－TMT基因。

從GenBank中下載其他1 3種植物γ－TMT蛋白序列，涉及到豆科、禾本科、十字花科、茄科等多個(gè)物種。用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示，不同來源的γ－TMT基因聚為3類。紫花苜蓿γ－TMT與豆科植物蒺藜苜蓿γ－TMT親緣關(guān)系最近，其次是大豆（圖6）。用DNAMAN 6.0軟件對(duì)紫花苜蓿γ－TMT蛋白與大豆、蒺藜苜蓿、水稻（Oryzasativa）、擬南芥等13種植物中的γ－TMT蛋白同源性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示與上述幾種模式植物的同源性分別為58.19%，54.87%，51.07%和50.12%。γ－TMT蛋白在序列上的差異主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)的N端，中部的功能區(qū)則比較保守。說明雖然不同生物之間的γ－TMT序列同源性有一定差異，卻具有功能上的保守性，推測有可能形成類似的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

圖3 紫花苜蓿γ－TMT基因ORF擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Electrophoresis result of the ORF

2.3 MsTMT基因在不同組織的表達(dá)特異性

在同一株紫花苜蓿上分別取根、莖、葉、花以及莢果，Real－time PCR分析各組織的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，以花中Ms TMT基因的表達(dá)量為對(duì)照，葉片中表達(dá)量最高，為對(duì)照的218倍，且明顯高于其他組織，莖中表達(dá)量次之，為對(duì)照的44倍，根中表達(dá)量為對(duì)照的12.8倍，莢果中表達(dá)量為對(duì)照的11.8倍（圖7）。說明該基因在紫花苜蓿各個(gè)器官中均有表達(dá)，且在含有光合器官的綠色組織中表達(dá)量最高。一般認(rèn)為植物細(xì)胞中α－生育酚的合成部位在綠色植物細(xì)胞所特有的質(zhì)體中［23］。葉綠體含有葉綠素，是重要的質(zhì)體，主要存在于植物體綠色部分的薄壁組織細(xì)胞中，是綠色植物進(jìn)行光合作用的場所。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該基因的表達(dá)與質(zhì)體的分布有很強(qiáng)的相關(guān)性。

圖4 MsTMT蛋白序列Blast分析Fig.4 The Blast analysis result of MsTMT protein

2.4 不同逆境脅迫處理下Ms TMT基因表達(dá)分析

2.4.1 鹽脅迫下Ms TMT基因表達(dá)特性 以處理0 h為對(duì)照，分析NaCl處理不同時(shí)間Ms TMT基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明，MsTMT基因受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，脅迫處理2 h后該基因的表達(dá)就已經(jīng)開始上調(diào)，至8 h之前表達(dá)量上調(diào)不明顯，僅為對(duì)照的2.1～2.4倍，8 h后基因表達(dá)量迅速上升，24 h后該基因的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的21.4倍（圖8）。

2.4.2 PEG脅迫下Ms TMT基因表達(dá)特性 以處理0 h為對(duì)照，分析PEG模擬干旱處理不同時(shí)間Ms TMT基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明，隨PEG誘導(dǎo)時(shí)間的變化，MsTMT基因表達(dá)呈明顯單峰趨勢，在4 h表達(dá)量最高，為對(duì)照的4.3倍（圖9）。

2.4.3 黑暗脅迫下Ms TMT基因表達(dá)特性 以處理0 h為對(duì)照，分析黑暗脅迫不同時(shí)間Ms TMT基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明，隨脅迫時(shí)間的延長，Ms TMT基因的表達(dá)量出現(xiàn)先下降后上升趨勢。黑暗脅迫24 hMs TMT表達(dá)量最低，僅為對(duì)照的9%，隨后基因的表達(dá)量迅速上升，72 h基因的表達(dá)量為對(duì)照的12.3倍（圖10）。

2.4.4 低溫脅迫下MsTMT基因表達(dá)特性 以處理0 h為對(duì)照，分析低溫脅迫不同時(shí)間MsTMT基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明，低溫脅迫后，Ms TMT基因表達(dá)量均低于對(duì)照（圖11）。

圖5 MsTMT基因全長核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.5 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of MsTMT gene

2.4.5 ABA脅迫下MsTMT基因表達(dá)特性 以處理0 h為對(duì)照，分析外源ABA處理不同時(shí)間MsTMT基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明，受ABA誘導(dǎo)后該基因的表達(dá)量沒有明顯變化（圖12），說明該基因表達(dá)不受外源ABA誘導(dǎo)。

3 討論

本研究得到紫花苜蓿MsTMT基因的全長cDNA序列。對(duì)MsTMT氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)該蛋白有一個(gè)腺苷脫氨基酶信號(hào)（SLSTDDP），屬于甲基轉(zhuǎn)移酶家族（Ado Met－MTases），包含有2個(gè)保守的S－腺苷甲硫氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SAM－domain）XXDXGCGIG、VXXPGGXXIX，這與已知的棉花（Gossypiumspp.）、大豆等的γ－TMT結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一致［6，22，23］。

圖6 MsTMT蛋白與其他13種γ－TMT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree ofγ－TMT protein and other thirteen proteins

圖7 MsTMT基因的組織表達(dá)特異性Fig.7 Organ－specific expression pattern of the MsTMT gene

圖8 MsTMT基因在NaCl脅迫下的表達(dá)模式分析Fig.8 Expression pattern of MsTMT in response to NaCl stress

圖9 MsTMT基因在PEG脅迫下的表達(dá)模式Fig.9 Expression pattern of MsTMT in response to PEG stress

圖10 MsTMT基因在黑暗脅迫下的表達(dá)模式Fig.10 Expression pattern of MsTMT in response to dark stress

圖11 MsTMT基因在4℃低溫脅迫下的表達(dá)模式Fig.11 Expression pattern of MsTMT in response to low temperature stress

圖12 MsTMT基因在ABA處理下的表達(dá)模式Fig.12 Expression pattern of MsTMT in response to ABA treatment

本研究利用Real－time PCR方法檢測了MsTMT基因在紫花苜蓿中的組織表達(dá)特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MsTMT基因在各器官中均有表達(dá)，但各器官的表達(dá)峰度不同，葉片中表達(dá)量最高。歐陽青等［24］研究了Bo TMT在結(jié)球甘藍(lán)（Brassicaoleraceavar.capitata）不同器官中的表達(dá)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bo TMT在結(jié)球甘藍(lán)的各器官中均有表達(dá)，但在花和葉片中的表達(dá)量明顯高于根、莖和種子。一般認(rèn)為植物細(xì)胞中α－生育酚的生物合成部位是質(zhì)體，主要存在于植物體綠色部分的薄壁組織細(xì)胞中，是綠色植物進(jìn)行光合作用的主要場所。在植物的有色組織（如綠色的葉片）中，α－生育酚是含量最高的生育酚類型，而在非綠色組織（如根、種子）中，α－生育酚含量很低，絕大部分為其生物合成前體γ－生育酚［25］。γ－TMT的作用是催化γ－生育酚轉(zhuǎn)化為α－生育酚，有研究表明在γ－TMT缺失的突變型擬南芥葉片中，γ－生育酚含量顯著提高，而α－生育酚消失，重新導(dǎo)入γ－TMT后，葉片又可合成α－生育酚［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MsTMT基因的表達(dá)與質(zhì)體的分布有很強(qiáng)的相關(guān)性。

維生素E中由于有酚基的存在，使其具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可以保護(hù)蛋白質(zhì)不受到光合損傷，避免膜結(jié)構(gòu)發(fā)生脂類過氧化。當(dāng)植物受到諸如強(qiáng)光、干旱、高鹽和極端溫度等逆境脅迫后，體內(nèi)的活性氧（ROS）會(huì)增加，ROS的積累會(huì)誘導(dǎo)抗氧化物質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)正常植株進(jìn)行逆境處理，會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的增加，從而提高植株對(duì)自由基的清除能力［12，13］。據(jù)報(bào)道，在逆境脅迫下，維生素E生物合成途徑中的某些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)會(huì)被誘導(dǎo)，如經(jīng)由強(qiáng)光處理，擬南芥hppd和hpt均會(huì)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，而tc突變株并沒有出現(xiàn)上調(diào)，γ－TMT基因表達(dá)量幾乎沒有變化［12］。Abbasi等［26］通過RNAi干擾技術(shù)分別構(gòu)建了抑制煙草（Nicotianatabacum）hpt和γ－TMT基因表達(dá)的株系，分別用NaCl和山梨醇模擬鹽脅迫和滲透脅迫逆境，研究轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)逆境處理的耐受性，結(jié)果表明，hpt基因被抑制的株系對(duì)2種逆境的耐受性明顯下降，但是γ－TMT基因被抑制的株系會(huì)增強(qiáng)對(duì)山梨醇滲透逆境的抗性，卻缺乏了對(duì)鹽的耐受性。說明生育酚的總量及組成不同所產(chǎn)生的抗逆性及抗逆機(jī)理也不盡相同。本研究通過模擬不同逆境（NaCl脅迫、PEG脅迫、黑暗脅迫、低溫脅迫以及ABA脅迫），對(duì)MsTMT基因的抗逆性進(jìn)行探討。發(fā)現(xiàn)Ms TMT基因受NaCl脅迫、PEG脅迫以及黑暗脅迫表達(dá)量上調(diào)，但各脅迫下MsTMT基因表達(dá)上調(diào)趨勢不同，這可能是由這3種逆境的不同脅迫機(jī)制所造成。

光合激素，如甲基茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA），同樣可以影響維生素E的生物合成。維生素E合成途徑相關(guān)的基因，如hppd，啟動(dòng)子區(qū)具有ABA反應(yīng)元件。逆境誘導(dǎo)JA積累能夠抑制光合作用，但活化了抗氧化物質(zhì)合成的基因。有研究報(bào)道在抗旱植物中，內(nèi)源SA與α－生育酚含量之間存在著相關(guān)性?？寡趸镔|(zhì)（維生素E）的水平，體現(xiàn)了植物對(duì)外界環(huán)境和內(nèi)環(huán)境的應(yīng)激能力［14］。說明維生素E既可以起到抗氧化作用，也可以作為一種信號(hào)，傳遞氧化還原的狀態(tài)。本研究對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行外源ABA處理后，發(fā)現(xiàn)外源ABA基本不影響該基因的表達(dá)，這可能與Ms TMT啟動(dòng)子區(qū)域的響應(yīng)元件有一定關(guān)系?；蛟S其他光合激素如JA、SA會(huì)對(duì)MsTMT的表達(dá)產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步的證實(shí)。

γ－TMT是維生素E合成途徑中最后一步的關(guān)鍵酶，催化γ－生育酚向α－生育酚的轉(zhuǎn)化，對(duì)于改變維生素E組成有重要作用。通過過量表達(dá)γ－TMT基因來提高植物體內(nèi)α－生育酚的比例已經(jīng)涉及到多個(gè)物種［11，27］，但在栽培利用面積最廣泛的紫花苜蓿上的研究幾乎沒有，且對(duì)γ－TMT的研究多集中在其生育酚合成方面，對(duì)其抗逆性的研究很少，本試驗(yàn)將繼續(xù)構(gòu)建植物增強(qiáng)表達(dá)載體，進(jìn)行Ms TMT基因功能研究，進(jìn)一步為改善紫花苜蓿的品質(zhì)和抗性創(chuàng)造條件。

［1］ 潘衛(wèi)東，李曉峰，陳雙燕，等.植物維生素E合成相關(guān)酶基因的克隆及其在體內(nèi)功能研究進(jìn)展［J］.植物學(xué)通報(bào)，2006，23（1）：68－77.

［2］ 王改琴，李維，王恬.維生素E對(duì)家禽抗氧化、免疫功能和繁殖性能的影響研究進(jìn)展［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，30（6）：1－5.

［3］ 王軍，田玉民，劉璐.維生素E對(duì)畜禽肉色穩(wěn)定性影響的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，（33）：14545－14547.

［4］ 胡英考.植物維生素E合成及其生物技術(shù)改良［J］.中國生物工程雜志，2004，24（1）：32－35.

［5］ 何河，方熱軍.日糧中添加維生素E對(duì)牛肉品質(zhì)的影響［J］.飼料博覽，2008，（2）：13－16.

［6］ Shintani D，DellaPenna D.Elevating the Vitamin E content of plants through metabolic engineering［J］.Science，1998，282（11）：2098－2100.

［7］ Cho E A，Lee C A，Kim Y S，etal.Expression of gamma－tocopherol methyltransferase transgene improves tocopherol composition in lettuce（LatucasativaL.）［J］.Molecules and Cells，2005，19（1）：16－22.

［8］ Van Eenennaam A L，Lincoln K，Durrett T P，etal.Engineering vitamin E content：fromArabidopsismutant to soy oil［J］.The Plant Cell，2003，15（12）：3007－3019.

［9］ 張一弓，張麗靜，傅華.植物維生素E合成酶基因克隆及其逆境生理研究進(jìn)展［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（5）：235－242.

［10］ Munné－Bosch S.The role ofα－tocopherol in plant stress tolerance［J］.Journal of Plant Physiology，2005，162（7）：743－748.

［11］ Vidi P A，Kanwischer M，Baginsky S，etal.Tocopherol cyclase（VTE1）localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles［J］.The Journal of Biological Chemistry，2006，281（16）：11225－11234.

［12］ Collakova E，DellaPenna D.The role of homogentisate phytyltransferase and other tocopherol pathway enzymes in the regulation of tocopherol synthesis during abiotic stress［J］.Plant physiology，2003，133（10）：930－940.

［13］ Noctor G，F(xiàn)oyer C H.Ascorbate and glutathione：keeping active oxygen under control［J］.Plant Biology，1998，49（6）：249－279.

［14］ Ghimire B K，Seong E S，Goh E J，etal.Improving antioxidant activity in transgenicCodonopsislanceolataplants via overexpression of theγ－tocopherol methyltransferase（γ－TMT）gene［J］.Plant Growth Regulation，2011，63（1）：1－6.

［15］ 李殷.植物維生素E生物合成途徑及調(diào)控［D］.上海：復(fù)旦大學(xué)，2009.

［16］ 張冬玲，劉建寧，王運(yùn)琦，等.山西省中部地區(qū)紫花苜蓿引種試驗(yàn)［J］.中國草食動(dòng)物，2010，30（5）：43－46.

［17］ 夏銀素，王成章，詹發(fā)柏，等.苜蓿草粉飼糧添加纖維素酶對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)及養(yǎng)分利用率的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（5）：183－191.

［18］ 李源，劉貴波，高洪文，等.紫花苜蓿種質(zhì)耐鹽性綜合評(píng)價(jià)及鹽脅迫下的生理反應(yīng)［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（4）：79－86.

［19］ 姜健，楊寶靈，夏彤，等.紫花苜蓿耐鹽種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（1）：119－125.

［20］ Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2－△△CTmethod［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［21］ Bergmüller E，Porfirova S，Drmann P.Characterization of anArabidopsismutant deficient inγ－tocopherol methyltransferase［J］.Plant Molecular Biology，2003，52（8）：1181－1190.

［22］ 胡英考，孟憲萍，李雅軒，等.大豆γ－生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達(dá)分析［J］.大豆科學(xué)，2011，30（2）：198－204.

［23］ 鄒禮平，高和平.棉花γ－生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因全長cDNA的克隆與序列分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（3）：490－493.

［24］ 歐陽青，樊春濤，孫卉，等.結(jié)球甘藍(lán)γ－生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶cDNA的克隆、分析及其異源表達(dá)酶蛋白的功能研究［J］.自然科學(xué)進(jìn)展，2003，13（7）：709－715.

［25］ Grusak M A.Improving the nutrient composition of plants to enhance human nutrition and health［J］.Plant Biology，1999，50（6）：133－161.

［26］ Abbasi A R，Hajirezaei M，Hofius D，etal．Specific roles ofα－andγ－tocopherol in abiotic stress responses of transgenic tobacco［J］．Plant physiology，2007，143（4）：1720－1738．

［27］ Lee B K，Kim S L，Kim K H，etal．Seed specific expression of perillaγ－tocopherol methyltransferase gene increases a－tocopherol content in transgenic perilla（Perillafrutescens）［J］．Plant Cell Tissue and Organ Culture，2008，92（1）：47－54．