羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育和功能研究

馬興勇，彭獻軍，蘇蔓，張樂新，周慶源，陳雙燕，程麗琴＊，劉公社＊

（1.中國科學院植物研究所資源植物研發(fā)重點實驗室，北京100093；2.中國科學院研究生院，北京100049）

＊干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫影響植物的生長發(fā)育，植物中相應發(fā)生一系列分子水平的變化來適應脅迫［1］。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控逆境相關基因在特異時空內(nèi)表達，是植物響應逆境的一個重要組成部分［2］。DREB（dehydration responsive element binding proteins）是植物中已知的與非生物脅迫相關的最重要的轉(zhuǎn)錄因子基因之一［1］。DREB轉(zhuǎn)錄因子分為DREB1和DREB2兩類，分別在植物響應低溫脅迫和滲透脅迫的過程中起作用［3］。DREB轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子上的DRE／CRT元件結(jié)合，激活下游一系列與非生物脅迫相關基因的表達［1］?；蛐酒治霰砻鳎瑑深怐REB轉(zhuǎn)錄因子的下游基因有重疊的部分但并不完全相同［4］。DREB2類轉(zhuǎn)錄因子除了響應滲透脅迫外，也響應高溫脅迫。另外，有些DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的表達受放牧［5］或創(chuàng)傷的誘導［6］。擬南芥（Arabidopsisthaliana）［3］、水稻（Oryzasativa）［7］和玉米（Zeamays）［8］等植物中克隆到的 DREB轉(zhuǎn)錄因子，已被證明可以用來提高植物的抗逆能力。許多研究者已經(jīng)將該類基因轉(zhuǎn)化到各種草坪草及牧草之中，并成功獲得了綜合抗性增強的轉(zhuǎn)基因植株［9］。

羊草（Leymuschinensis）隸屬禾本科（Gramineae）賴草屬，在我國東北和內(nèi)蒙古有廣泛分布［10］。羊草兼具重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值，是一種非常重要的鄉(xiāng)土草。羊草具有發(fā)達的根莖，可以通過根莖進行無性繁殖［11］。羊草具有耐寒和耐鹽堿的特點，對NaCl、Na2CO3處理的最高耐受濃度可分別達到600和175 mmol／L［12］。雖然羊草具有很好的抗逆能力，但是關于其抗逆分子機理的研究較少。目前，羊草中僅有幾丁質(zhì)酶ClassⅡ、乙醛脫氫酶、光系統(tǒng)Ⅱ外周蛋白和V－ATPase等少數(shù)基因被克?。?3－17］。作者所在的實驗室也成功地克隆并鑒定了羊草中的1個DREB轉(zhuǎn)錄因子基因［5］。目前羊草的基因組信息相對較少，這限制了羊草抗逆分子機理的研究和相關基因的克隆。通過構(gòu)建c DNA文庫并對部分cDNA克隆測序來獲得ESTs，是獲得基因組信息的有效方法［18］。Jin等［19］構(gòu)建了堿性環(huán)境脅迫下羊草葉和根的cDNA文庫，并測序得到了1 228條ESTs。王麗娟等［20］通過構(gòu)建羊草葉片c DNA文庫并測序得到了285條ESTs。然而，通過這種方法獲得的ESTs數(shù)量仍然是有限的。目前，GenBank的核酸數(shù)據(jù)庫（nucleotide database）中僅有羊草序列72條，EST數(shù)據(jù)庫（dbEST）中僅有羊草序列1 692條，2個數(shù)據(jù)庫共有2條DREB序列。DREB轉(zhuǎn)錄因子屬于ERF家族中的DREB亞家族，在擬南芥基因組中該亞家族有57個成員。據(jù)此，羊草DREB亞家族基因序列尚有潛力可挖。作者所在實驗室對羊草轉(zhuǎn)錄組進行了高通量測序，獲得了大量EST。本研究通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對EST數(shù)據(jù)中的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因進行系統(tǒng)挖掘，并選擇其中的Lc DREB21基因進行功能驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

羊草和擬南芥，2010年種植于中國科學院植物研究所培養(yǎng)室，恒溫23℃，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序 羊草種植在塑料缽中，8周大的幼苗（4葉期）用于實驗。幼苗經(jīng)低溫和干旱處理，取樣，混合后提取RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，建庫，使用454 GS FLX進行測序（測序工作由中國科學院國家基因研究中心完成）。測序數(shù)據(jù)通過GoPipe進行GO（gene ontology）分析，通過NCBI的blast進行核酸和蛋白的同源性分析，通過與CDD數(shù)據(jù)庫比對進行KOG（clusters of eukaryotic orthologous groups）分析。

1.2.2 RACE 羊草幼苗經(jīng)400 mmol／L NaCl處理，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板。采用Clontech公司的RACE試劑盒。Lc DREB21基因引物和UPM引物序列分別為：5′－TGAAGTTATCCCTATTGCTCCGCATGAC－3′；5′－CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT－3′。

1.2.3 熒光定量PCR 對于鹽脅迫，將羊草幼苗根部浸入400 mmol／L NaCl溶液，干旱脅迫用20%PEG6000模擬，ABA處理使用濃度為100μmol／L，低溫處理將羊草苗放進4℃冰箱。4種處理后，分別在0，1，3，8，12和24 h時取材，提取RNA。經(jīng)DNase I消化的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用兩步法進行熒光定量PCR?；蛱禺愐铮?′－TAAACCCGTCATCGCCATCT－3′，5′－CCTGGAAGTATCCCAACCAAA－3′；內(nèi)參（actin）引物：5′－CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC－3′，5′－GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT－3′。

1.2.4 酵母單雜交Lc DREB21基因經(jīng)Sal I和Pst I酶切后，連接到酵母表達載體p Bridge的Sal I和Pst I酶切位點間，得到重組載體pBridge－BD－Lc DREB21。重組載體pBridge－BD－Lc DREB21轉(zhuǎn)化含有His3和LacZ報道基因的酵母AH109株系。用pBridge空載體轉(zhuǎn)化酵母AH109株系作為負對照，用轉(zhuǎn)有BD－Lc DREB3a的AH109株系作為陽性對照。轉(zhuǎn)化方法參照Clontech試劑盒的酵母轉(zhuǎn)化方法。將上述3個轉(zhuǎn)化酵母菌株在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d的酵母用于含有X－gal的Z－buffer顯色。

1.2.5 擬南芥轉(zhuǎn)化及篩選 利用pCAMBIA1302的NcoI和SpeI位點，構(gòu)建了pCAMBIA1302－35S：：LcDREB21－GFP。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥［21］。使用含25 mg／L潮霉素的MS培養(yǎng)基，篩選得到35S：：Lc DREB21－GFP陽性擬南芥株系。

1.2.6 熒光觀察 取在篩選培養(yǎng)基上生長4 d的35S：：Lc DREB21－GFP T1代陽性植株，壓片，使用ZEISS LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 通過blast分析，篩選羊草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中的ERF家族基因，結(jié)合擬南芥ERF家族基因的蛋白序列構(gòu)建了鄰接樹（neighbor－joining tree）。參考已有的研究，鑒定了羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子基因所在的分支。利用羊草和擬南芥中DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列再次構(gòu)建鄰接樹。序列比對使用MUSCLE［22］，比對后的序列用Bio Edit進行編輯［23］。使用MEGA5構(gòu)建鄰接樹，設置bootstrap重復次數(shù)為1 000［24］。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育研究

通過Roche 454測序技術，作者所在實驗室對羊草轉(zhuǎn)錄組進行了測序。經(jīng)過對測序數(shù)據(jù)分析，得到屬于羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族的EST 26條。采用鄰接法，利用羊草EST和擬南芥基因組中的DREB亞家族基因的蛋白序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。參照已有的研究，將羊草DREB亞家族EST分為4個類群［25］（圖1）。羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子在4個類群有較均勻地分布，這說明DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族在羊草和擬南芥基因組中是保守的。同時也表明，本測序數(shù)據(jù)覆蓋度好，拼接準確。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，DREB1／CBF類轉(zhuǎn)錄因子位于第3類群，DREB2類轉(zhuǎn)錄因子位于第4類群。DREB1／CBF類轉(zhuǎn)錄因子和DREB2類轉(zhuǎn)錄因子分別在植物耐低溫和耐滲透脅迫中起作用。目前，對位于第1類群基因功能的研究較少，第2類群基因的功能還不清楚。

在擬南芥中，DREB2A（At5g05410）基因受干旱和高鹽脅迫誘導，過表達后可以提高擬南芥耐干旱和高鹽脅迫的能力［26］。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，與At5g50410同源性最高的是Lc DREB21，它們都位于第4類群。通過RACE得到了Lc DREB21的編碼區(qū)全長，并對其功能進行了深入研究。

圖1 羊草和擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of DREB transcription factors in L.chinensis ESTs and A.thaliana genome

2.2 Lc DREB21編碼區(qū)全長的獲得

通過轉(zhuǎn)錄組測序，得到的Lc DREB21 EST長度為486 bp。通過NCBI中的blast分析，其與大麥（Hordeum vulgare）和小麥（Triticumaestivum）的DREB基因具有很高同源性，可能包括CDS 3′末端。根據(jù)Lc DREB21 3′端序列，設計了5′引物進行RACE，得到了900 bp左右的特異性擴增片段（圖2）。PCR產(chǎn)物回收并測序，得到的5′序列與原序列拼接得到總長為949 bp的序列。用DNAMAN軟件對得到的序列進行ORF預測，并與大麥同源基因比較，結(jié)果表明其具有完整的CDS（GenBank登入號為：JN860437）。LcDREB21編碼1個由278個氨基酸殘基組成的蛋白。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫工具對其進行保守結(jié)構(gòu)域預測，結(jié)果顯示其第76～139位氨基酸殘基構(gòu)成一個典型的AP2保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 Lc DREB21在脅迫條件下的表達模式

對羊草幼苗分別進行PEG、ABA、NaCl和低溫處理，在0，1，3，8，12和24 h等6個時間點分別取材，用于熒光定量PCR分析（圖3）。結(jié)果表明，Lc DREB21表達受PEG、ABA和NaCl的誘導，3種處理下，mRNA的積累量分別在24，12和3 h達到高峰。另外，Lc DREB21的表達基本不受低溫誘導。

2.4 Lc DREB21的轉(zhuǎn)錄激活功能

一個轉(zhuǎn)錄因子起作用需要結(jié)合特定的啟動子，并激活或抑制下游基因的表達。使用酵母單雜交系統(tǒng)，證明了Lc DREB21具有激活功能。首先，將Lc DREB21克隆到pBridge載體上，并轉(zhuǎn)化酵母AH109。得到的陽性酵母菌株能夠在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上生長。而且，陽性菌株在劃線培養(yǎng)后，經(jīng)含有X－gal的Z－buffer顯色后變藍。轉(zhuǎn)BD－Lc DREB3aAH109株系作為陽性對照得到了類似結(jié)果［5］。而轉(zhuǎn)有p Bridge空載體的AH109作為陰性對照，不能在缺少His和Trp的SD培養(yǎng)基上生長。以上結(jié)果說明，Lc DREB21具有轉(zhuǎn)錄激活能力（圖4）。然而與對照相比，Lc DREB21的激活能力明顯較弱。

圖2 LcDREB21的5′RACE擴增結(jié)果Fig.2 Amplified results of LcDREB21 by 5′RACE.

圖3 脅迫和ABA處理下LcDREB21的表達模式Fig.3 Expression patterns of LcDREB21 in response to various treatments

2.5 Lc DREB21的亞細胞定位

通過潮霉素篩選，得到了T1代轉(zhuǎn)35S：：Lc DREB21－GFP和35S：：GFP的擬南芥陽性苗。轉(zhuǎn)基因擬南芥苗經(jīng)壓片后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。在轉(zhuǎn)35S：：GFP的擬南芥中，綠色熒光在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布。在轉(zhuǎn)35S：：Lc DREB21－GFP的擬南芥中，綠色熒光只分布在細胞核中。以上結(jié)果表明，Lc DREB21專一性定位在細胞核中（圖5）。

圖4 酵母單雜交Fig.4 One hybrid system of yeast

圖5 LcDREB21亞細胞定位Fig.5 Subcellular location of LcDREB21

3 討論

對擬南芥和水稻基因組中DREB的系統(tǒng)發(fā)育研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族的多數(shù)類群在2種植物中同時存在，在進化上是保守的［25］。所以新測序物種DREB轉(zhuǎn)錄因子的分析，可以參照擬南芥和水稻中的研究，如在小麥［27］和玉米［28］研究中的應用。本研究共得到26條DREB轉(zhuǎn)錄因子EST，參照擬南芥中DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育研究，將羊草DREB亞家族EST分為4個類群［25］。其中位于第一和第二類群的共有11條，在擬南芥和水稻中，對DREB亞家族這2個類群中基因的研究較少，它們的功能還不清楚［25］。DREB1類轉(zhuǎn)錄因子和DREB2類轉(zhuǎn)錄因子分別位于第3和第4類群，Lc DREB21位于第四類群，屬于DREB2類轉(zhuǎn)錄因子。多數(shù)DREB2類轉(zhuǎn)錄因子的表達受干旱和高鹽脅迫誘導，如AtDREB2A、AtDREB2B和OsDREB2A等［3，7，29］。然而，OsDREB2B和ZmDREB2A的表達響應干旱和高鹽脅迫誘導的同時，也受低溫脅迫的誘導［8，29］。與多數(shù)DREB轉(zhuǎn)錄因子類似，Lc DREB21的表達受干旱和高鹽脅迫的誘導，基本不受冷誘導。另外，LcDREB21具有轉(zhuǎn)錄激活功能和核定位能力。因此，LcDREB21很可能在植物應對干旱和高鹽脅迫的過程中起作用。

在擬南芥、水稻和玉米等植物中已克隆得到了多個DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，然而牧草中的研究還比較少［9］?；蚪M信息的匱乏，限制了羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆和功能研究。本研究發(fā)掘的26條DREB轉(zhuǎn)錄因子EST，豐富了羊草原來僅有2條DREB的核酸和EST數(shù)據(jù)庫，為進一步研究DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物耐低溫和滲透脅迫過程中的作用奠定了基礎。另外，有些DREB轉(zhuǎn)錄因子的表達受刈割或創(chuàng)傷的誘導，如Peng等［5］報道了Lc DREB3a的表達受刈割的誘導，Hong和Kim［6］報道了Ca DREBLP1的表達受創(chuàng)傷的誘導。對Lc DREB21在刈割下的表達進行了半定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)其表達量沒有明顯變化（結(jié)果未列出）。因此，羊草DREB家族亞家族基因中有的與創(chuàng)傷或刈割有關，有的未必有關，這方面的研究有助于理解羊草耐牧的分子機理。

基因工程在最近20年取得了迅猛發(fā)展，具有在分子水平上定向改造遺傳性狀的優(yōu)勢，在牧草新品種培育研究中的應用也越來越廣［30］。一些基因已被用于基因工程改良羊草，如 Wang等［31］通過組成型表達Ta LEA3基因，提高了羊草的耐旱能力。與單個功能基因相比，通過轉(zhuǎn)化DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，可以激活下游一系列抗逆相關基因的表達，從而能提高植物的綜合抗性。因此，羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子用于基因工程改良是非常好的選擇。

［1］ Yamaguchi－Shinozaki K，Shinozaki K.Transcriptinonal regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses［J］.Annual Review of Plant Biology，2006，57（1）：781－803.

［2］ Rushton P J，Somssich I E.Transcriptional control of plant genes responsive to pathogens［J］.Current Opinion in Plant Biology，1998，1（4）：311－315.

［3］ Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，etal.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP／AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought－and low－temperature－responsive gene expression，respectively，inArabidopsis［J］.The Plant Cell，1998，10（8）：1391－1406.

［4］ Sakuma Y，Maruyama K，Osakabe Y，etal.Functional analysis of an arabidopsis transcription factor，DREB2A，involved in drought－responsive gene expression［J］.The Plant Cell Online，2006，18（5）：1292－1309.

［5］ Peng X J，Ma X Y，F(xiàn)an W H，etal.Improved drought and salt tolerance ofArabidopsisthalianaby transgenic expression of a novel DREB gene fromLeymuschinensis［J］.Plant Cell Reports，2011，30（8）：1－10.

［6］ Hong J－P，Kim W T.Isolation and functional characterization of theCa－DREBLP1 gene encoding a dehydration－responsive element binding－factor－like protein 1 in hot pepper（CapsicumannuumL.cv.Pukang）［J］.Planta，2005，220（6）：875－888.

［7］ Dubouzet J G，Sakuma Y，Ito Y，etal.OsDREBgenes in rice，OryzasativaL.，encode transcription activators that function in drought－，high－salt－and cold－responsive gene expression［J］.The Plant Journal，2003，33（4）：751－763.

［8］ Qin F，Kakimoto M，Sakuma Y，etal.Regulation and functional analysis ofZm DREB2Ain response to drought and heat stresses inZeamaysL［J］.The Plant Journal，2007，50（1）：54－69.

［9］ 王舟，劉建秀.DREB／CBF類轉(zhuǎn)錄因子研究進展及其在草坪草和牧草抗逆基因工程中的應用［J］.草業(yè)學報，2011，20（1）：222－236.

［10］ 劉公社，齊冬梅.羊草生物學研究進展［J］.草業(yè)學報，2004，13（5）：6－11.

［11］ 李海燕，李建東，徐振國，等.內(nèi)蒙古圖牧吉自然保護區(qū)羊草種群營養(yǎng)繁殖特性的比較［J］.草業(yè)學報，2011，20（5）：19－25.

［12］ 顏宏，趙偉，尹尚軍，等.羊草對不同鹽堿脅迫的生理響應［J］.草業(yè)學報，2006，15（6）：49－55.

［13］ 金華，安曉雯，姜國斌.羊草ClassⅡ幾丁質(zhì)酶基因的克隆及序列分析［J］.農(nóng)業(yè)科學與技術，2009，10（4）：96－100.

［14］ 金華，王璐，樸永哲，等.羊草OEE1基因的克隆及鹽脅迫下的表達［J］.西北植物學報，2011，31（5）：881－885.

［15］ 李蕊沁，馮樹丹，于瑩，等.羊草幾丁質(zhì)酶ClassⅡ基因的克隆、生物信息學分析及原核表達［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2010，12（2）：103－110.

［16］ 李新玲，吳姝菊，王全偉.羊草乙醛脫氫酶基因Lc ALDH的克隆與表達分析［J］.草業(yè)學報，2011，20（4）：187－193.

［17］ 呂召志，馮樹丹，于瑩，等.羊草LVAP1基因的克隆及生物信息學分析［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報（自然科學版），2010，26（6）：651－656.

［18］ Adams M，Kelley J，Gocayne J，etal.Complementary DNA sequencing：expressed sequence tags and human genome project［J］.Science，1991，252：1651－1656.

［19］ Jin H，Plaha P，Park J Y，etal.Comparative EST profiles of leaf and root ofLeymuschinensis，a xerophilous grass adapted to high p H sodic soil［J］.Plant Science，2006，170（6）：1081－1086.

［20］ 王麗娟，金治平，王能飛，等.羊草葉片cDNA文庫的構(gòu)建及部分表達序列標簽的分析［J］.草業(yè)學報，2009，18（1）：65－71.

［21］ Clough S J，Bent A F.Floral dip：a simplified method forAgrobacteriummediated transformation ofArabidopsisthaliana［J］.The Plant Journal，1998，16（6）：735－743.

［22］ Edgar R C.MUSCLE：multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput［J］.Nucleic Acids Research，2004，32（5）：1792－1797.

［23］ Hall T A.BioEdit：a user－friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95／98／NT［C］.Nucleic Acids Symposium Series，1999，41：95－98.

［24］ Tamura K，Peterson D，Peterson N，etal.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731－2739.

［25］ Nakano T，Suzuki K，F(xiàn)ujimura T，etal.Genome－wide analysis of the ERF gene family inArabidopsisand rice［J］.Plant Physiology，2006，140（2）：411－432.

［26］ Sakuma Y，Maruyama K，Osakabe Y，etal.Functional analysis of anArabidopsistranscription factor，DREB2A，involved in drought－responsive gene expression［J］.The Plant Cell，2006，18（5）：1292－1309.

［27］ Zhuang J，Chen J M，Yao Q H，etal.Discovery and expression profile analysis of AP2／ERF family genes fromTriticum aestivum［J］.Molecular Biology Reports，2011，38（2）：745－753.

［28］ Zhuang J，Deng D X，Yao Q H，etal.Discovery，phylogeny and expression patterns of AP2－like genes in maize［J］.Plant Growth Regulation，2010，62（1）：51－58.

［29］ Matsukura S，Mizoi J，Yoshida T，etal.Comprehensive analysis of rice DREB2－type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress－responsive genes［J］.Molecular Genetics and Genomics，2010，283（2）：185－196.

［30］ 馬江濤，王宗禮，黃東光，等.基因工程在牧草培育中的應用［J］.草業(yè)學報，2010，19（6）：248－262.

［31］ Wang L，Li X，Chen S，etal.Enhanced drought tolerance in transgenicLeymuschinensisplants with constitutively expressed wheatTa LEA3［J］.Biotechnology Letters，2009，31（2）：313－319.