酸中毒條件下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

毛勝勇，何文波，朱偉云

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京210095）

＊瘤胃急性酸中毒及亞急性酸中毒是反芻動(dòng)物突然或長(zhǎng)期采食高精料而帶來(lái)的一類瘤胃代謝異常疾病。瘤胃酸中毒給畜牧生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為預(yù)防該病的發(fā)生，減少因其帶來(lái)的危害，人們?cè)谏a(chǎn)中常應(yīng)用包括緩沖劑、電子受體、乳酸菌臨床疫苗和莫能菌素等手段來(lái)阻止或減緩瘤胃中毒的發(fā)生或發(fā)展過(guò)程［1－3］，但上述添加劑的使用效果欠理想，在一些大型牧場(chǎng)，瘤胃酸中毒仍是當(dāng)前反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中的主要疾病之一。因此，尋求可有效預(yù)防與治療瘤胃酸中毒的技術(shù)手段也一直備受動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)者關(guān)注。

阿卡波糖是一類用于治療Ⅱ型糖尿病（非胰島素依賴型）的藥物，其主要通過(guò)抑制淀粉酶和葡萄糖苷酶的活性而減緩單糖的生成速度［4］。近年來(lái)有報(bào)道表明，該藥物可用于提高奶牛瘤胃內(nèi)p H值，治療急性酸中毒［5，6］。但綜合相關(guān)進(jìn)展，目前該方面的報(bào)道仍較少，一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)仍不充分，如阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵不同飼料原料的效果是否一致、日糧底物與阿卡波糖之間是否存在互作效應(yīng)，在急性或亞急性酸中毒條件下，添加阿卡波糖對(duì)發(fā)酵參數(shù)的影響程度是否一致，這些問(wèn)題都不清楚。為較充分地闡明阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響，本研究應(yīng)用批次培養(yǎng)技術(shù)，以混合日糧或單一原料為底物，在體外模擬急性或亞急性酸中毒條件下，研究了不同阿卡波糖用量對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響，擬為人們?cè)谏a(chǎn)中應(yīng)用該藥物來(lái)預(yù)防及治療酸中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物飼養(yǎng)及瘤胃液的獲取

阿卡波糖（Acarbose）購(gòu)自江蘇省南京軍區(qū)總醫(yī)院。

試驗(yàn)選用4頭裝有永久性瘤胃瘺管的本地成年公山羊，單圈飼喂，以玉米（Zeamays）、豆粕和羊草（Leymus chinensis）為主的精粗比例為4∶6的日糧預(yù)飼1周，每天8：00和20：00飼喂，自由飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，于飼喂后2 h分別從4頭山羊的瘤胃內(nèi)抽取其內(nèi)容物，放入充滿CO2的塑料瓶?jī)?nèi)。在厭氧條件下，將所獲瘤胃液經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，攪拌30 s混勻，而后與預(yù)熱至39℃的厭氧培養(yǎng)基混合，瘤胃液與厭氧培養(yǎng)基的體積比為1∶2。

1.2 培養(yǎng)基的組成及配置

培養(yǎng)基的 組 成 及 配 置：292 mg K2HPO4、240 mg KH2PO4、480 mg （NH4）2SO4、480 mg NaCl、100 mg MgSO4·7H2O、60.1 mg CaCl2·2H2O、4 000 mg Na2CO3，加水至1 L，培養(yǎng)基通CO2至基本無(wú)色后，添加600 mg半胱氨酸鹽酸，繼續(xù)通 CO2至完全無(wú)色［7－9］。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)于2010年4－6月進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.1 混合日糧條件下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、對(duì)照組和處理組。處理組中的阿卡波糖添加量分別為0.1，0.2和0.4 mg／m L；空白組不添加底物和阿卡波糖；對(duì)照組不添加阿卡波糖。各組均設(shè)置4個(gè)重復(fù)，底物均為0.8 g玉米＋0.2 g羊草（過(guò)40目篩）。每瓶接種40 m L培養(yǎng)基和瘤胃液的混合液，39℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)期間，每隔3 h用氣壓計(jì)平衡氣壓以保證發(fā)酵的正常進(jìn)行，發(fā)酵至終點(diǎn)后，冰浴終止發(fā)酵，立即測(cè)定p H值，并收集上清液，凍存于－20℃冰箱內(nèi)，備測(cè)氨氮、乳酸和VFA（volatile fatty acid，VFA）濃度等。

1.3.2 不同精料原料底物條件下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響 精料分別為高粱（Sorghumbicolor）、玉米、大麥（Hordeumvulgare）和小麥（Triticumaestivum）（0.45 mm），各底物稱取1 g，阿卡波糖添加量為0，0.1，0.2，0.4 mg／m L，其他條件同1.3.1，39℃體外培養(yǎng)24 h后取樣備測(cè)同1.3.1指標(biāo)。

1.3.3 模擬急性酸中毒下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響 采用體外批次培養(yǎng)，將瘤胃液和39℃培養(yǎng)基混合液（體積比為1∶2）60 m L分裝于120 m L發(fā)酵瓶中，發(fā)酵底物為0.75 g玉米（0.45 mm）、0.25 g纖維二糖、0.25 g甘露糖和0.25 g木糖，阿卡波糖添加量為0，0.1，0.2和0.4 mg／m L，實(shí)驗(yàn)各處理均設(shè)4個(gè)重復(fù)，發(fā)酵瓶用乙丁基橡膠塞密封后以鋁蓋封口，隨后置于39℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，結(jié)束后取樣備測(cè)指標(biāo)，取樣方式、保存方法和指標(biāo)測(cè)定同1.3.1和1.3.2。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

氨氮測(cè)定參照 Weathburn［10］；乳酸測(cè)定參照張龍翔等［11］；VFA 測(cè)定參照秦為琳［12］。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步處理之后，1.3.1和1.3.3結(jié)果分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中One－way ANOVA分析，1.3.2數(shù)據(jù)采用 General Linear Model（GLM）分析，顯著性水平置于0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合日糧條件下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

與對(duì)照相比，添加阿卡波糖極顯著提高了發(fā)酵液p H值、乙丙比、異丁酸和戊酸濃度（P＜0.001），乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和TVFA濃度極顯著降低（P＜0.001），其中0.4 mg／m L阿卡波糖組的p H值提高了25%（表1）；乳酸濃度下降了98%；但對(duì)異戊酸濃度無(wú)顯著影響（P＝0.794）。與對(duì)照相比，阿卡波糖處理組的氨氮濃度顯著升高（P＜0.001），各處理組的氨氮濃度較對(duì)照提高3倍以上。隨阿卡波糖添加量的逐漸增加，除異戊酸外，阿卡波糖對(duì)其他指標(biāo)的影響呈線性效應(yīng)和二次方效應(yīng)。

2.2 不同精料原料條件下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵影響

添加阿卡波糖極顯著提高了4種底物下發(fā)酵液的p H值和氨氮濃度及乙丙比（P＜0.001）（表2），其中0.4 mg／m L阿卡波糖組的p H較對(duì)照組上升了17%（高粱）、20%（玉米）、18%（大麥）和21%（小麥），且底物與阿卡波糖間存在顯著的互作效應(yīng)（P＜0.001）；添加阿卡波糖極顯著降低了發(fā)酵體系中的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和TVFA濃度（P＜0.001），除乙酸和TVFA外，日糧與阿卡波糖間在影響其他指標(biāo)上存在顯著的互作效應(yīng)（P＜0.05）。

2.3 急性酸中毒下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

與對(duì)照相比，添加阿卡波糖皆極顯著提高了發(fā)酵液p H值、丙酸和戊酸濃度（P＜0.001）（表3），顯著提高了氨氮和丁酸濃度（P＜0.05），極顯著降低了乳酸濃度（P＜0.001），顯著降低了乙丙比（P＜0.05），其中0.4 mg／m L阿卡波糖組的p H值提高了6.4%，乳酸濃度下降了98%；但對(duì)乙酸、異丁酸、異戊酸和TVFA濃度無(wú)顯著影響（P＞0.05）。隨阿卡波糖添加量的逐漸增加，阿卡波糖對(duì)乳酸、乙酸和戊酸濃度與p H的影響呈線性效應(yīng)和二次方效應(yīng)（P＜0.001），但對(duì)氨氮、丙酸、丁酸、戊酸和乙丙比僅呈線性效應(yīng)（P＜0.05）。

表1 阿卡波糖對(duì)p H、乳酸、氨氮及總揮發(fā)性脂肪酸及其組成的影響Table 1 Effects of acarbose addition on the p H，lactate，NH3－N，TVFA production and its composition in in vitro fermentation

3 討論

3.1 混合日糧條件下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

本研究顯示，添加阿卡波糖可有效提高發(fā)酵液p H值，降低乳酸及VFA含量，說(shuō)明阿卡波糖可有效地抑制瘤胃微生物活力，結(jié)合其用于治療Ⅱ型糖尿病的作用機(jī)制，推測(cè)阿卡波糖可能通過(guò)抑制瘤胃微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)α－糖苷酶和α－淀粉酶的活力，進(jìn)而減緩瘤胃微生物對(duì)多糖的酶解速度，從而減緩瘤胃p H值的快速下降［4］。Mc Laughlin等［5］研究發(fā)現(xiàn)，與Na HCO3和莫能菌素相比，添加阿卡波糖更顯著的提高了急性酸中毒試驗(yàn)中奶牛瘤胃p H，有效緩解了瘤胃中乳酸的累積。Speight和Harmon［13］體外研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，每kg日糧中添加1.2～9.5 mg的阿卡波糖能有效阻止p H的下降和VFA的累積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加阿卡波糖降低了乙酸、丙酸和丁酸濃度，并顯著減少了TVFA產(chǎn)量，提高了乙丙比，結(jié)果與上述報(bào)道基本一致。Marta等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在高產(chǎn)泌乳奶牛日糧中添加0.75 g／d阿卡波糖能有效地減少瘤胃p H＜5.6的持續(xù)時(shí)間，乳酸產(chǎn)生菌包括牛鏈球菌和乳酸利用菌埃氏巨型球菌在總菌中的比例下降。本研究表明，阿卡波糖可顯著降低乳酸含量（下降比例高于92%）。由于乳酸是反芻動(dòng)物急性酸中毒的主要誘因，并主要由牛鏈球菌及乳酸桿菌等發(fā)酵生成［15］；因此，綜合上述報(bào)道，阿卡波糖可能通過(guò)抑制牛鏈球菌的數(shù)量來(lái)減少乳酸生成，從而阻止乳酸的大量累積。同時(shí)，瘤胃中的乳酸可通過(guò)丙烯酸途徑生成丙酸，因而乳酸生成量可直接影響丙酸產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，雖乙酸與丙酸濃度皆極顯著下降，但乙酸的下降幅度低于丙酸，其可能原因與丙酸的2條生成途徑（琥珀酸與丙烯酸途徑）皆受到極顯著的抑制有關(guān)，這也是導(dǎo)致乙丙比反而增高的根本原因；本研究還發(fā)現(xiàn)，較對(duì)照組相比，異丁酸和戊酸的濃度反而有所增高，由于異丁酸和戊酸主要由瘤胃微生物發(fā)酵支鏈氨基酸生成，這一跡象是否暗示阿卡波糖具有促進(jìn)支鏈氨基酸的分解效應(yīng)，目前尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

表2 以玉米、高粱、大麥及小麥為底物時(shí)添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響Table 2 Effect of acarbose on the p H，NH3－N，VFA and its composition in vitro fermentation with sorghum，corn，barley，wheat used as substrate

表3 急性酸中毒下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響Table 3 Effect of acarbose addition on actuate rumen acidosis

3.2 不同精料原料條件下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

本實(shí)驗(yàn)中，在不同原料條件下，阿卡波糖皆顯著提高了發(fā)酵液的p H值，降低了乙酸、丙酸、丁酸和TVFA濃度，結(jié)果與Speight和Harmon［13］報(bào)道一致。研究表明，由于谷物類飼料的淀粉含量與淀粉類型組成不一，瘤胃微生物對(duì)不同的谷物底物的發(fā)酵速率也不一致，日糧中谷物飼料發(fā)酵速度越快，越易引發(fā)瘤胃酸中毒［16］。據(jù)Leonard［17］報(bào)道，與玉米比較，麥類谷物最易造成綿羊或奶牛酸中毒，本實(shí)驗(yàn)中，就各底物的對(duì)照而言，24 h發(fā)酵終止時(shí)，大麥和小麥組的乙酸、丙酸及TVFA濃度皆高于玉米和高粱組，結(jié)果顯示麥類谷物發(fā)酵速率最快，該結(jié)果與Leonard［17］報(bào)道一致。本研究顯示，雖大麥和小麥皆是發(fā)酵速度較快的谷物，但小麥組的丁酸濃度低于其他組。Lettat等［18］報(bào)道，瘤胃微生物發(fā)酵小麥易生成乳酸，而發(fā)酵玉米易生成丁酸，因此，小麥組丁酸濃度較低與其底物類型有關(guān)。本研究同時(shí)闡明，阿卡波糖對(duì)各種底物條件下VFA及乙丙比的影響幅度不同，添加0.2 mg／m L的阿卡波糖，高粱、玉米、大麥和小麥的丙酸濃度較對(duì)照組分別下降了82.33%，78.58%，70.63%和71.34%（P＜0.01）；丁酸濃度相應(yīng)降低了84.62%，83.96%，75.55%和60.95%（P＜0.01）；TVFA 濃度相應(yīng)降低了58.64%，65.43%，53.52%和46.58%（P＜0.01）；乙丙比相應(yīng)提高了4.72，2.41，1.56和2.31（P＜0.01），該結(jié)果顯示，阿卡波糖對(duì)以高粱和玉米為底物的發(fā)酵體系的影響較大，其具體原因可能與所用谷物原料組分的具體含量有關(guān)，在本研究所用的4類谷物中，玉米的淀粉含量最高，但小麥淀粉的發(fā)酵速率最高，互作分析結(jié)果表明，底物與阿卡波糖間存在互作效應(yīng)，該結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了阿卡波糖對(duì)這些指標(biāo)的影響程度與日糧底物有關(guān)。

3.3 急性酸中毒下添加阿卡波糖對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

據(jù)報(bào)道，在體外發(fā)酵中，當(dāng)發(fā)酵液精料濃度達(dá)到并超過(guò)20 g／L時(shí)，培養(yǎng)體系中發(fā)酵液的p H值低于5.0，乳酸濃度高達(dá)10 mmol／L，該值與動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)生急性酸中毒時(shí)的p H值及乳酸濃度大致相當(dāng)［19－21］。在本研究中，除阿卡波糖的添加濃度為0.4 mg／m L組外，其余各組的p H值均低于5.0，乳酸濃度皆高于10 mmol／L，說(shuō)明該體系可模擬瘤胃急性酸中毒；結(jié)果顯示，阿卡波糖可顯著降低各處理的乳酸濃度，提示該藥物具有預(yù)防瘤胃急性酸中毒發(fā)生的潛力。但本研究也發(fā)現(xiàn)，使用阿卡波糖顯著提高了發(fā)酵體系丙酸、丁酸和戊酸濃度，推測(cè)可能與發(fā)酵終點(diǎn)較低的p H值有關(guān)。在本研究中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的p H值為4.66，而阿卡波糖處理組的p H均在5.0左右，由于瘤胃微生物對(duì)低p H極其敏感，因此，較對(duì)照組相比，阿卡波糖處理組的一些參與丙酸和戊酸生成的微生物可能仍具有較高的活性，結(jié)果導(dǎo)致處理組中的丙酸和戊酸濃度等較高。但遺憾的是，本研究未及時(shí)檢測(cè)發(fā)酵體系中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，因此本研究?jī)H能提供一種假說(shuō)，即在急性酸中毒條件下，阿卡波糖可能通過(guò)影響瘤胃p H間接影響瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)物的組成及產(chǎn)量。這一假說(shuō)是否正確，尚需后續(xù)工作驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在體外模擬亞急性瘤胃酸中毒和急性瘤胃酸中毒條件下，發(fā)現(xiàn)添加阿卡波糖均顯著提高了發(fā)酵液p H值，降低了乳酸濃度，在以玉米、小麥、高粱和大麥為底物的條件下，阿卡波糖對(duì)玉米和高粱發(fā)酵參數(shù)的影響程度最大，在影響p H、氨氮、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸濃度和乙丙比上，日糧底物與阿卡波糖之間存在顯著的互作效應(yīng)；急性酸中毒下，添加阿卡波糖對(duì)TVFA無(wú)顯著影響。結(jié)果顯示，阿卡波糖能減緩瘤胃微生物發(fā)酵谷物類飼料的速率，有預(yù)防與治療瘤胃酸中毒的潛力。

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