干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿葉片和根系多胺代謝的影響

劉義，張春梅，謝曉蓉，閆芳，胡丹

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖734000；2.張掖市甘州區(qū)兔兒壩天然植被管護(hù)站，甘肅 張掖734000）

＊紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界上廣泛栽培的豆科牧草之一。目前，人們已充分認(rèn)識(shí)到紫花苜蓿在發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)、建植人工草地、保護(hù)草地生態(tài)環(huán)境、綠化、美化生活環(huán)境等方面具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和重要的社會(huì)效益。多胺（polyamines，PAs）是一類廣泛存在于原核生物及真核生物中具有強(qiáng)烈生物活性的低分子量脂肪族含氮堿。高等植物含有的多胺主要有腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm），以游離態(tài)、結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)3種形態(tài)存在［1］。多胺含量的變化與植物的抗旱性關(guān)系密切［2－6］。

干旱是紫花苜蓿出苗及成苗的限制因子之一［7］。本試驗(yàn)以隴東紫花苜蓿為材料，研究干旱脅迫下紫花苜蓿葉片、根系中多胺含量、精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC，EC 4.1.1.19）、鳥氨酸脫羧酶（ornithine deearboxylase，ODC，EC 4.1.1.17）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO，EC 1.5.3.3）活性的動(dòng)態(tài)變化，探討紫花苜蓿體內(nèi)多胺代謝與抗旱性的關(guān)系，以進(jìn)一步探明內(nèi)源多胺在紫花苜?？购敌灾械淖饔?，為深入開展苜蓿抗旱機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

選用耐旱性較強(qiáng)的隴東苜蓿為試驗(yàn)材料［8］。采用盆栽方式，盆口直徑為29 cm，深度40 cm。盆栽用土為河西內(nèi)陸灌區(qū)灌漠土，土壤全氮、全磷和有機(jī)質(zhì)含量分別為0.041%，0.009%和0.294%，田間飽和持水量19.72%，風(fēng)干土土壤含水量為4.7%。每盆裝粉碎過(guò)篩的風(fēng)干土10.4 kg，將尿素4.5 g、硫酸鉀4.5 g、過(guò)磷酸鈣15.0 g和腐熟有機(jī)肥200 g，作為底肥與過(guò)篩風(fēng)干土混勻后裝盆。試驗(yàn)在干旱棚內(nèi)完成，設(shè)3個(gè)土壤水分處理：正常供水（對(duì)照，CK）、中度干旱脅迫（moderate stress，MS）和重度干旱脅迫處理（serious stress，SS），其土壤水分含量分別維持在土壤田間持水量的（75±5）%，（55±5）%和（35±5）%。每處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)。稱重法控制土壤水分。于2010年11月18日播種，每盆12穴，每穴2粒，子葉展開后定苗，每盆5株，再設(shè)置空白對(duì)照10盆。在冬前正常供水，返青后（翌年3月25日起）開始控水，讓其自然干旱到田間持水量的（55±5）%和（35±5）%，此后一直維持該含水量。于脅迫處理后0，1，3，5，7 d取樣，選取真葉和根系測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，不同時(shí)間換株取樣。各處理取樣3次重復(fù)，指標(biāo)測(cè)定時(shí)各樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 PAs含量的測(cè)定 在劉懷攀等［9］方法的基礎(chǔ)上稍加變動(dòng)。取冰凍樣品1.0 g，加入6 m L預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸冰浴研磨，冰浴浸提1 h后離心（12 000 r／min，30 min，4℃）。取1 m L上清液加入10 m L帶蓋塑料離心管中，加入20μL苯甲酰氯，再加入1 m L 2 mol／L NaOH，渦漩1 min后于37℃水浴反應(yīng)30 min。加入2 m L飽和NaCl溶液，混勻后用2 m L乙醚萃取，5 000 r／min離心5 min后，取1 m L醚相真空干燥，用1 m L甲醇渦漩溶解后過(guò)0.45μm的濾膜。取10μL用Shimadzu（島津）LC－2010A型高效液相色譜儀檢測(cè)：紫外檢測(cè)器，層析柱為反向C18柱，流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（水）＝60∶40，流速0.7 m L／min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。以腐胺、亞精胺、精胺（Sigma產(chǎn)品）制備標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線。多胺含量單位為nmol／g。

1.2.2 ADC、ODC活性的測(cè)定 參照趙福庚和劉友良［10］的方法并略加修改，取1.0 g冰凍材料，加入5 m L預(yù)冷的提取液（100 mmol／L磷酸緩沖液，p H 為8.0，內(nèi)含5 mmol／L EDTA、0.1 mmol／L苯甲基磺酰氟、1 mmol／L磷酸吡哆醛、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、5 mmol／L二硫蘇糖醇、20 mmol／L抗壞血酸、0.43 mmol／L硫代硫酸鈉），于冰浴中充分研磨，12 000 r／min冷凍離心15 min（4℃），取上清液鹽析、透析進(jìn)行純化。取0.3 m L純化后的提取液加入0.2 m L 25 mmol／L底物（p H 7.5，ADC活性測(cè)定時(shí)加L－精氨酸，ODC活性測(cè)定時(shí)加L－鳥氨酸），反應(yīng)之后進(jìn)行苯甲?；?，用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定波長(zhǎng)254 nm處的OD值。以腐胺制備標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶的活性以每g鮮質(zhì)量樣品提取的酶液在單位時(shí)間內(nèi)催化底物生成的產(chǎn)物Put的量來(lái)計(jì)算，酶活單位用nmol／（g·h）來(lái)表示。

1.2.3 PAO活性的測(cè)定 參照汪天等［11］的方法，用N，N－二甲基苯胺和4－氨基氨替吡啉作顯色劑，Spm啟動(dòng)反應(yīng)，記錄OD550處吸光值的變化，酶活性計(jì)算以反應(yīng)液每min在550 nm處吸光值變化0.001為1個(gè)酶活單位（U），結(jié)果用“U／g”來(lái)表示（以鮮質(zhì)量計(jì)算）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下紫花苜蓿葉、根中游離態(tài)多胺含量的變化

干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗葉片中3種游離態(tài)多胺（Put、Spd、Spm）的含量均大幅度增加（表1），隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降，且脅迫程度越大，多胺的增加幅度越大。中度脅迫處理下，Put、Spd、Spm的含量在脅迫后5 d出現(xiàn)峰值，分別比CK增加72.87%，68.91%和76.27%；重度脅迫處理下，3種多胺的含量在脅迫后3 d出現(xiàn)峰值，分別比CK提高1.57，1.46和1.19倍。各處理間3種多胺含量的差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），整個(gè)脅迫期間各處理葉片多胺含量表現(xiàn)為重度脅迫＞中度脅迫＞CK。

表1 干旱脅迫下紫花苜蓿葉片中游離態(tài)多胺含量的變化（珔x±SD）Table 1 Changes of free－polyamines contents in leaves of alfalfa under drought stress nmol／g

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，紫花苜蓿根中多胺含量先上升后下降（表2），變化趨勢(shì)與葉片中相似。中度脅迫處理下，根中Put、Spd含量峰值分別出現(xiàn)在脅迫后3 d，比CK增加73.38%和38.79%，Spm含量在脅迫5 d時(shí)最高，比CK增加90.62%；重度脅迫處理下，根中3種多胺含量均在脅迫1 d后出現(xiàn)峰值，較葉片中提早出現(xiàn)，之后迅速下降。各處理根中Put、Spd、Spm含量均低于葉片，整體表現(xiàn)為重度脅迫＞輕度脅迫＞CK。根和葉中Put、Spd、Spm含量之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.946，0.808和0.817，表明根和葉中多胺含量呈極顯著相關(guān)（r0.01＝0.745）關(guān)系。

表2 干旱脅迫下紫花苜蓿根系中游離態(tài)多胺含量的變化（珔x±SD）Table 2 Changes of free－polyamines contents in roots of alfalfa under drought stress nmol／g

2.2 干旱脅迫下紫花苜蓿葉、根中多胺脫羧酶活性的變化

精氨酸脫羧酶（ADC）和鳥氨酸脫羧酶（ODC）為多胺生物合成的關(guān)鍵酶。干旱脅迫下紫花苜蓿葉片和根系中ADC、ODC活性變化趨勢(shì)相似（圖1，2）。隨脅迫程度增大，二者活性均增大，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，二者活性先增大后減小。

圖1 干旱脅迫下紫花苜蓿ADC活性的變化Fig.1 Changes of ADC activities of alfalfa under drought stress

中度和重度脅迫處理下，紫花苜蓿葉片中ADC活性分別在脅迫后5和1 d開始下降，而根中ADC活性分別在脅迫后3和1 d開始下降，各處理間ADC活性均達(dá)極顯著差異（圖1）。

脅迫處理下，葉片和根系ODC活性在脅迫3 d后同時(shí)達(dá)到最高。對(duì)葉片和根中ADC、ODC活性與Put含量進(jìn)行相關(guān)分析，呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.817，0.806和0.853，0.904（r0.01＝0.745）。

2.3 干旱脅迫下紫花苜蓿葉、根中多胺氧化酶活性的變化

植物體內(nèi)多胺氧化酶（PAO）催化亞精胺和精胺分解產(chǎn)生的H2O2，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成一定的傷害。干旱脅迫下，紫花苜蓿葉片和根系中PAO活性上升，處理期間PAO活性上升幅度隨脅迫程度加重而增大，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理PAO活性呈先增大后減小的趨勢(shì)（圖3），這與Spd、Spm含量變化相似。干旱脅迫下，紫花苜蓿葉中PAO活性與Spd、Spm含量相關(guān)系數(shù)為0.925和0.917，根中相關(guān)系數(shù)為0.785和0.871，表明PAO活性與Spd、Spm含量極顯著相關(guān)（r0.01＝0.745）。

圖2 干旱脅迫下紫花苜蓿ODC活性的變化ig.2 Changes of ODC activities of alfalfa under drought stress

圖3 干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗PAO活性的變化Fig.3 Changes of PAO activities of alfalfa under drought stress

3 討論

植物感受干旱脅迫時(shí)，多胺水平升高，PAs含量的積累與植物抗旱性關(guān)系密切［2－6］。PA可通過(guò)穩(wěn)定質(zhì)膜和提高細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶（超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶）活性［12］以及提高ABA含量或改變不同激素成分的含量［13］來(lái)增強(qiáng)對(duì)滲透脅迫的抵抗能力。逆境脅迫下，活性氧的產(chǎn)生與清除體系與多胺存在著重要的關(guān)聯(lián)［14，15］。苜蓿幼苗葉片多胺含量顯著升高［16］。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫誘使紫花苜蓿游離態(tài)Put、Spd、Spm的含量增加及ADC、ODC、PAO代謝酶活性提高。由此可以推斷，干旱脅迫下，紫花苜蓿體內(nèi)多胺代謝的變化是對(duì)干旱逆境的一種抵御和適應(yīng)機(jī)制。這與關(guān)軍峰等［2］和牛明功等［3］在小麥（Triticumaestivum）的研究結(jié)果一致。Spd和Spm能夠顯著增強(qiáng)低溫脅迫下茄子（Solanummelongena）幼苗的耐冷性［17］。Sara等［18］研究認(rèn)為，不同多胺在抗旱中的作用因不同植物而存在差異［3－6］。

PAO是催化生物體內(nèi)PAs降解的關(guān)鍵酶之一，Put和Spd的過(guò)度積累將作為一種很好的底物激發(fā)PAO活性，PAO通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PAs的水平和生成物濃度參與植物體對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程［19］。干旱脅迫下，紫花苜蓿中PAO活性與Spd、Spm含量變化趨勢(shì)相似且呈極顯著相關(guān)，可能是Spd、Spm二者含量的增加反饋致其氧化酶PAO活性增高，進(jìn)而維持多胺代謝平衡［20］。本試驗(yàn)中，中度脅迫處理下紫花苜蓿幼苗根中多胺含量峰值比葉片中出現(xiàn)較早，說(shuō)明根中多胺反應(yīng)較葉中更敏感。這可能由于干旱來(lái)臨時(shí)根系最先感知并迅速產(chǎn)生化學(xué)信號(hào)向地上部葉片傳遞［19］。

在植物體內(nèi)，Put的生物合成途徑主要有2條：一條是以鳥氨酸為前體，在ODC的作用下形成Put；另一條以L－Arg為前體，在ADC的作用下間接形成Put。Spd和Spm分別由S－腺苷蛋氨酸脫羧酶（SAMDC）催化形成脫羧的dcSAM生成。在植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，ADC、ODC和SAMDC活性往往升高，Put的合成酶ADC和ODC的活性增加，合成的Put增多，而Put可轉(zhuǎn)化為Spd，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為Spm，致使總PAs含量顯著增加［20］。銅脅迫下，黃瓜（Cucumissativus）嫁接苗根系A(chǔ)DC、ODC和SAMDC活性升高，表明嫁接幼苗根系PAs含量維持在較高水平有利于提高黃瓜幼苗抗銅脅迫能力［21］。本研究結(jié)果顯示，干旱脅迫下紫花苜蓿葉片和根中ADC、ODC活性與Put含量變化趨勢(shì)一致，表明ADC、ODC共同調(diào)控脅迫條件下植物Put的合成代謝。這與汪耀富等［4］的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

干旱脅迫誘使紫花苜蓿幼苗葉片、根系中Put、Spd、Spm含量增加。ADC、ODC、PAO活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)。PAO活性與Spd、Spm含量變化趨勢(shì)相似且呈極顯著相關(guān)關(guān)系，ADC、ODC活性與Put含量呈極顯著正相關(guān)。葉和根中多胺代謝顯著相關(guān)。3種多胺處于動(dòng)態(tài)平衡中，共同緩解紫花苜蓿受到的干旱脅迫，表明多胺代謝與紫花苜?？购敌躁P(guān)系密切。

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