樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的胰腺癌與黑素瘤疫苗

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物治療科 汪治宇

1.前言

免疫細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的臨床應(yīng)用包括抗腫瘤的反應(yīng)性T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移和使用“治療性的”疫苗，并正在許多領(lǐng)域迅速發(fā)展[1-10]。當(dāng)前以在動物腫瘤模型中得到驗(yàn)證的新型樹突狀細(xì)胞（DC）為基礎(chǔ)的疫苗已進(jìn)入臨床，有望為腫瘤的免疫治療提供一條新的有效途徑。臨床前研究表明，化療或放療所誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞減少可提高幾種不同的、以細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療方法的抗腫瘤效果。例如，從清髓劑量的全身照射（TBI）和整體（即含駐地T細(xì)胞）骨髓移植（BMT）所致的淋巴細(xì)胞減少癥中逐漸恢復(fù)的小鼠體內(nèi)，以DC為基礎(chǔ)的疫苗可加速T細(xì)胞的重建及活化。在小鼠的同源及同種異源模型中，清髓性TBI和整體BMT之后的DC瘤苗接種是一種誘導(dǎo)已形成的腫瘤衰退或生長延遲的有效手段。當(dāng)疫苗接種與重建同時(shí)進(jìn)行時(shí)可誘發(fā)最有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，而延遲的疫苗接種可能降低T細(xì)胞的抗腫瘤效力（可能為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和/或髓源性抑制細(xì)胞的重建所致）。

盡管這一領(lǐng)域的臨床試驗(yàn)表明，不論臨床研究終點(diǎn)還是免疫學(xué)研究終點(diǎn)都獲得了一些肯定的結(jié)果，但以DC為基礎(chǔ)的多種疫苗在接種后，抗腫瘤免疫反應(yīng)并未獲得令人滿意的持久性。人們通過對以細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫療法抑制腫瘤的機(jī)制的研究，尋找改進(jìn)的機(jī)會。這些改進(jìn)包括通過選擇性抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞共刺激，以及聯(lián)合重組細(xì)胞因子和其他被定義為存在“免疫增強(qiáng)”活動的分子，進(jìn)而打破對腫瘤“自身”抗原的耐受。在T細(xì)胞的抗腫瘤功能的“質(zhì)量”受損的情況下，可應(yīng)用IL-15、抗-CD40或者程序性死亡1（PD-1）等進(jìn)行援救，潛在地為以DC為基礎(chǔ)的疫苗提供了更寬泛的使用空間。

2.應(yīng)用CCL-21以增強(qiáng)黑素瘤DC疫苗的效力

在過去的幾年里，人們對于趨化因子的關(guān)注日益增長，這是一種在免疫及炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的小分子蛋白質(zhì)，它可以指導(dǎo)白細(xì)胞趨向受損部位及免疫反應(yīng)初次啟動的部位（次級淋巴組織，如淋巴結(jié)、脾臟、Peyer's 斑和扁桃體）。有四類趨化因子（C，CC，CXC和CX3C），筆者依據(jù)蛋白質(zhì)氨基末端的半胱氨酸殘基數(shù)目及位置對它們進(jìn)行命名。這些分子通過PTX敏感的G蛋白偶聯(lián)受體與其靶細(xì)胞進(jìn)行相互作用。不同的趨化因子作用于不同種類的白細(xì)胞，從而根據(jù)特定情況下的需求，調(diào)控免疫效應(yīng)細(xì)胞向病變組織的趨化。在早期的工作中，人們對應(yīng)用趨化因子誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)進(jìn)行了研究，其中包括應(yīng)用趨化因子基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。憑借這種方法，當(dāng)應(yīng)用可產(chǎn)生RANTES（一種CC趨化因子）的基因來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞時(shí)，將會產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)[11]。這一免疫反應(yīng)可歸功于，至少可部分歸功于向腫瘤部位聚集的單核細(xì)胞及效應(yīng)T細(xì)胞。相似的，由于淋巴細(xì)胞效應(yīng)器增多所致的效應(yīng)也可見于其他應(yīng)用，例如：Mig（CXCL9）和淋巴細(xì)胞趨化因子（XCL1）。這種方法的缺點(diǎn)之一是它依賴于效應(yīng)細(xì)胞向腫瘤部位的遷移，以啟動抗腫瘤反應(yīng)，但其前提是負(fù)載腫瘤的宿主體內(nèi)須貯存有大量循環(huán)的效應(yīng)細(xì)胞。

筆者首先對次級淋巴組織趨化因子SLC/CCL-21進(jìn)行了研究，它是一種發(fā)現(xiàn)于淋巴結(jié)高內(nèi)皮微靜脈內(nèi)的CC趨化因子。據(jù)報(bào)道，這是一種特異性吸引幼稚T細(xì)胞和DCs的趨化因子。通過重組腺病毒載體（將SLC/CCL-21基因與病毒載體重組）感染負(fù)載轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤抗原的DCs（TL-DC）產(chǎn)生SLC/CCL-21（見圖1），從而筆者能夠通過創(chuàng)造新的有功能的“淋巴結(jié)樣”結(jié)構(gòu)來特異性地召集幼稚T細(xì)胞至皮膚注射TL-DC的部位（TL-DC相當(dāng)于抗原呈遞細(xì)胞，通過在局部產(chǎn)生SLC/CCL-21來誘導(dǎo)大量幼稚T細(xì)胞到達(dá)相應(yīng)部位）[12,13]。當(dāng)幼稚T細(xì)胞在接種部位遇到TL-DC，二者可通過共刺激及主要組織相容性抗原（MHC）分子Ⅰ和Ⅱ相互作用，如此便啟動了初級免疫反應(yīng)，隨之產(chǎn)生一種強(qiáng)大的系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)（由于激活的T 細(xì)胞從局部游出并通過外周血系統(tǒng)性地播散），這導(dǎo)致了皮膚部位局部腫瘤及末梢血管部位的轉(zhuǎn)移性疾病的削弱。因此，SLC/CCL-21在體內(nèi)即可誘發(fā)抗腫瘤反應(yīng)，又可增強(qiáng)TL-DC引起的抗腫瘤反應(yīng)。同樣，直接在腫瘤組織注入轉(zhuǎn)基因DCs，腫瘤細(xì)胞自身就會表達(dá)SLC/CCL-21，進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞大量、持久地流入腫塊內(nèi)部，而引流淋巴結(jié)（DLN）內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量僅有短暫升高。TL-DC被限制在腫瘤部位，僅有很小的百分比遷移至DLN。浸潤腫瘤腫塊的T細(xì)胞在24h之內(nèi)即表達(dá)出CD25,并在7天之內(nèi)分泌出特異性針對腫瘤的IFN-α，而使腫瘤生長受到限制（圖2）。重要的是，相似的數(shù)據(jù)可在淋巴毒素-α基因已敲除、缺乏外周淋巴結(jié)的小鼠體內(nèi)獲得。后者首次證實(shí)了效應(yīng)T細(xì)胞可于淋巴結(jié)以外激活，進(jìn)而通過在體內(nèi)產(chǎn)生新的、有功能的、“淋巴結(jié)樣”的結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。

圖1：經(jīng)重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞（DC）后SLC/CCL-21表達(dá)情況比較。以Ad-GFP為對照，并設(shè)立空白對照組，實(shí)驗(yàn)組分為DC以每個(gè)細(xì)胞5,000（Ad-SLC 5K）或25,000（Ad-SLC 25K）個(gè)病毒顆粒的數(shù)量被轉(zhuǎn)染兩個(gè)亞組。采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA法檢測轉(zhuǎn)基因DC的上清。結(jié)果示SLC/CCL-21的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組，且Ad-SLC 5K亞組高于Ad-SLC 25K亞組。

基于此項(xiàng)工作，本課題組對人類TL-DC同樣進(jìn)行了基因修飾以分泌SLC/CCL-21，它與上述的小鼠研究相似，可以強(qiáng)有力地聚集人類幼稚CD4+及CD8+T細(xì)胞（此例在體外）[14]。重要的是，筆者首次證實(shí)了分泌SLC/CCL-21的TL-DC也可以顯著提高針對特異性黑色素瘤肽MART-1（圖3A）和gp100（圖3B）的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量。因此，表達(dá)SLC/CCL-21的TL-DC相當(dāng)于一個(gè)媒介，它既可以聚集幼稚T細(xì)胞，又能提高腫瘤特異性T細(xì)胞的數(shù)量。這些體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)成為了一項(xiàng)正在Moffitt癌癥中心進(jìn)行的針對黑色素瘤患者的臨床試驗(yàn)的依據(jù)，該試驗(yàn)名為“關(guān)于CCL-21腺病毒感染的MART-1/gp100肽激發(fā)的樹突狀細(xì)胞成熟地應(yīng)用細(xì)胞因子治療化療抵抗的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的劑量范圍的研究”。

3.一種針對胰腺癌的新策略：經(jīng)皮途徑安全地接種以DC為基礎(chǔ)的疫苗

在美國，胰腺癌的死亡率在所有癌癥中位列第四。手術(shù)完整切除局部腫瘤是治愈的唯一機(jī)會，但在確診時(shí)大部分（超過80％）病例已因腫瘤局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機(jī)會[15,16]。剩余20％胰腺癌患者接受手術(shù)后能夠長期生存者不足25％，而大部分仍將死于局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。失去手術(shù)機(jī)會的胰腺癌患者一經(jīng)診斷，總體上平均生存期在6個(gè)月之內(nèi)[16]。傳統(tǒng)的放化療在延長生存期方面也收效甚微，僅能延長幾周而非幾個(gè)月。局部治療，如近距離放射療法或外部柱狀放射，旨在使腫瘤縮小以延緩導(dǎo)致衰竭或威脅生命的癥狀，如黃疸或幽門梗阻的發(fā)生，但很少能使腫瘤縮小到允許手術(shù)切除。全身療法主要用于減輕癥狀而非延長生存期。值得強(qiáng)調(diào)的是，當(dāng)前的化療標(biāo)準(zhǔn)用藥，吉西他濱，已被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)，但其在減輕疼痛，改善體重下降及提高生存質(zhì)量方面有效，亦不能延長生存時(shí)間[16,17]。所以，我們需要研發(fā)新的療法來治療可手術(shù)的或不可手術(shù)的胰腺癌。

圖2：重組SLC/CCL-21或DC-SLC/CCL-21治療后腫瘤內(nèi)產(chǎn)INF-γ的T細(xì)胞計(jì)數(shù)。對腫瘤標(biāo)本的CD4和CD8進(jìn)行IFN-γ細(xì)胞因子染色。細(xì)胞數(shù)以腫瘤體積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并表示為細(xì)胞數(shù)/mm3。***，DC-SLC相對于所有其他各組（P＜0.001）。

圖3：Ad-SLC轉(zhuǎn)染的DC在體外激活黑色素瘤肽（MART-1和gp100）特異性T淋巴細(xì)胞的情況。 （A）未經(jīng)轉(zhuǎn)染的和經(jīng)Ad-SLC轉(zhuǎn)染的人類白細(xì)胞抗原（HLA）-A201陽性DC被MART-1激發(fā)后，腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞被不同程度的激活。刺激兩到三次以后，對MART-1四聚體進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)Ad-SLC和MART-1激發(fā)的DC可獲得數(shù)量最多的T淋巴細(xì)胞。（B）以巨細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染DC為對照，經(jīng)Ad-SLC轉(zhuǎn)染的DC能更大程度的激活T淋巴細(xì)胞對黑色素瘤肽gp100的反應(yīng)活性。

以免疫為基礎(chǔ)的療法已作為一種新的治療晚期胰腺癌的方法被提出[18]。這種療法的原理在于聚集并激活識別腫瘤特異性抗原的T細(xì)胞，由此提高局部及系統(tǒng)性的抗腫瘤效果[18]。DC為基礎(chǔ)的疫苗作為一種策略已在其他臨床前及臨床實(shí)體性腫瘤試驗(yàn)中得到肯定[19-21]。筆者前期已在同源小鼠模型上證實(shí)了腫瘤內(nèi)直接注射DC可介導(dǎo)小鼠體內(nèi)已形成的腫瘤結(jié)節(jié)的逆轉(zhuǎn)并為抵抗后續(xù)的腫瘤威脅提供有效的免疫。這種抗腫瘤效應(yīng)可被重組的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[22]或通過高度異源免疫原性的載體蛋白鑰孔戚血藍(lán)素預(yù)激發(fā)的DCs加強(qiáng)。

TNF-α是一種具有強(qiáng)大抗癌特性的多功能細(xì)胞因子，這已在許多臨床前及臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)[25,26]。TNF-α是已知的最強(qiáng)有力的凋亡誘導(dǎo)劑之一，但因其劑量限制性毒性使其不能全身給藥，研究人員正在找尋提高腫瘤內(nèi)TNF-α（及由之誘導(dǎo)的凋亡）水平的替代性方法。向腫瘤內(nèi)直接注射重組TNF-α蛋白理論上有效，但在胰腺腫瘤中實(shí)踐起來是不可行的，原因?yàn)槠浒胨テ诙蹋l繁經(jīng)皮向胰腺腫瘤穿刺所造成的后續(xù)問題，以及潛在的系統(tǒng)性吸收。

最近一種應(yīng)用腺病毒表達(dá)TNF-α的基因療法以其低毒性而被應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)[27]。TNFeradeTM是一種二代的、復(fù)制缺乏的腺病毒載體，它以一種可被放射誘導(dǎo)的、迅速的反應(yīng)表達(dá)人類TNF-αcDNA，Egr-1基因啟動子連接于人類TNF-αcDNA的起始位點(diǎn)。載體通過聚焦電離輻射確保TNF-α的分泌量得到控制，因此排除了相關(guān)的外周系統(tǒng)性吸收及附近的、正常的、未經(jīng)注射的組織的毒性。TNF-α可通過在腫瘤血管形成血凝塊及通過在局部產(chǎn)生損傷DNA的羥自由基對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接的細(xì)胞毒性而引起凋亡和壞死，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。在注射了包含TNF-αcDNA的腺病毒的腫瘤團(tuán)塊中，缺氧及細(xì)胞毒性均可提升凋亡指數(shù)[28]。Ⅰ期試驗(yàn)運(yùn)用載體已獲得了肯定的治療胰腺癌的療效，這就需要后續(xù)針對TNFeradeTM的隨機(jī)的、胰腺癌特異性的Ⅱ期試驗(yàn)[29]。

電離輻射也可在正常及癌癥組織中誘導(dǎo)顯著的凋亡。誘導(dǎo)凋亡是放療對腫瘤產(chǎn)生殺傷性的主要機(jī)制之一。一些研究已經(jīng)提出放療聯(lián)合DC為基礎(chǔ)的免疫療法效果顯著。劑量僅為1Gy的輻射后也會發(fā)生輻射誘導(dǎo)的凋亡[30]。

任何胰腺癌的局部治療方法的固有局限性在于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移所致的死亡。盡管TNFeradeTM或放療僅是局部給予且并未顯示出對遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的療效，而筆者假定一種輔助的治療策略（如DCs）為了更佳的臨床療效而必須具有可誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫的功能。此外，通過增加腫瘤抗原的暴露以增強(qiáng)DC的功能從而同時(shí)增強(qiáng)DC的局部效果。

基于這些理念及筆者的臨床前期動物實(shí)驗(yàn)研究，筆者開展了一項(xiàng)關(guān)于局部晚期或小范圍轉(zhuǎn)移的胰腺癌治療的臨床試驗(yàn)，它將TNFeradeTM、放療和KLH-激發(fā)的患者自身的DCs結(jié)合起來，名為“KLH-激發(fā)的患者自身的DCs聯(lián)合腫瘤內(nèi)直接注射TNFeradeTM治療局部晚期或小范圍轉(zhuǎn)移的胰腺癌的Ⅱ期實(shí)驗(yàn)”。局部晚期或小范圍轉(zhuǎn)移的胰腺癌（PCA）患者要進(jìn)行3個(gè)周期的治療，總共超過3周。每個(gè)周期包括數(shù)字體層攝影術(shù)（CT）引導(dǎo)的腫瘤內(nèi)注射，放射誘發(fā)的（2Gy/天×3）TNF-α腺病毒（表示為TNFeradeTM；GenVec，Inc.，Gaithersburg，美國）激活以誘導(dǎo)凋亡以及KLH激發(fā)的DCs。研究終點(diǎn)包括：生產(chǎn)疫苗及低死亡率的前提下完成治療的能力，治療前后安全地對腫瘤進(jìn)行取樣以檢驗(yàn)其生物學(xué)反應(yīng)，腫瘤反應(yīng)以及總體及各進(jìn)程中的無瘤生存率。對一般表達(dá)的PCA抗原（即MUC-1和CEA）的免疫反應(yīng)也運(yùn)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）進(jìn)行了測定。

到目前為止已有16名患者入組，觀察到的毒性包括惡心、體質(zhì)上的癥狀以及注射部位的疼痛。依據(jù)實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST），筆者在3名患者身上觀察到了部分臨床反應(yīng)，其中一名患者的轉(zhuǎn)移性肝損害消失（圖4）。2名患者的腫瘤降階到可進(jìn)行手術(shù)治療，其腫瘤標(biāo)記物CA-199已恢復(fù)正常（圖5所示為其中一人），而且在診斷后的6.5到7個(gè)月未發(fā)現(xiàn)患病的證據(jù)（NED）。到目前為止，已證實(shí)在對治療有反應(yīng)的患者體內(nèi)存在對KLH的免疫反應(yīng)，浸潤腫瘤的T細(xì)胞顯著升高及腫瘤腫塊的部分壞死。對新的針對PCA的瘤苗策略的評價(jià)分析證實(shí)其均有可行性和安全性，同時(shí)存在可接受的風(fēng)險(xiǎn)。筆者已觀察到抗腫瘤反應(yīng)，其他有關(guān)的生物學(xué)數(shù)據(jù)和即將入組的患者將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖4：治療13周后的胰腺癌患者的CT掃描，胰腺癌患者的治療13周后，可見肝轉(zhuǎn)移已消失。

圖5：經(jīng)TNFeradeTM、放療和KLH-激發(fā)的患者自身的DCs治療6周后（post-treatment 1）及9周后（post treatment 2），其中1名胰腺癌患者癌癥抗原（CA）199水平降低。

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