Smac過表達(dá)與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系

馮 為,曹洪濤,廖 明

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯市中心醫(yī)院胸外科,黑龍江佳木斯 154002)

Smac是第二種線粒體來源的 caspase激活劑,又稱低等電點(diǎn) IAP結(jié)合蛋白,位于線粒體內(nèi),在凋亡信號的刺激下,隨著細(xì)胞色素 C被釋放入細(xì)胞漿,通過與 IAPs結(jié)合發(fā)揮促凋亡作用。

肺癌是世界上常見的高發(fā)腫瘤之一。世界范圍內(nèi),每年發(fā)現(xiàn)的肺癌患者高達(dá)135萬例,其中約118萬位患者因此死亡[1]。近年來,國內(nèi)發(fā)病率呈遞增趨勢,目前已占男性惡性腫瘤的首位。由于診斷技術(shù)的局限性以及無特異性臨床表現(xiàn),超過70% 的患者就診時已經(jīng)存在轉(zhuǎn)移性疾病,從而不適宜手術(shù)治療,這些患者主要采取以化療為主的綜合治療。化療能夠延長生存期,但是化療藥物伴隨嚴(yán)重的毒副作用,對患者組織細(xì)胞損害大;不僅如此,化療藥物易引起腫瘤多耐藥性(multiple drug resistance,M DR),是患者化療效果有限的主要原因之一。

多細(xì)胞生物中存在兩種細(xì)胞清除機(jī)制:壞死和凋亡[2]。細(xì)胞凋亡是一種更為清潔、自然的細(xì)胞死亡方式。研究表明,細(xì)胞正常凋亡的破壞部分是由凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)或突變引起的。凋亡受阻將引發(fā)腫瘤發(fā)生及藥物耐受。因此,深刻理解肺癌細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)的機(jī)制對于抗癌藥物的研發(fā)和肺癌治療尤為重要。在這篇綜述中,我們主要討論肺癌細(xì)胞中凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及與凋亡抑制相關(guān)的因素。

1 細(xì)胞凋亡的主要途徑

在哺乳動物細(xì)胞中,細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要包括兩種不同的信號途徑:(1)外在途徑,由死亡受體的識別引發(fā) ,隨后激活 caspase-8;(2)內(nèi)在途徑,起始于細(xì)胞應(yīng)急反應(yīng),激活caspase-9[3]。這些不同的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終在凋亡的執(zhí)行階段實(shí)現(xiàn)匯聚,即激活 caspase-3和 /或 caspase-7。

1.1 細(xì)胞凋亡的外在途徑

在死亡受體途徑或外在凋亡途徑中,受體位于細(xì)胞膜上,由胞外配體結(jié)合并激活。比較有代表性的死亡受體包括成纖維細(xì)胞相關(guān)抗原受體即 Fas/CD95受體,腫瘤壞死因子受體 1,DR3、DR4和 DR5,它們屬于腫瘤壞死因子家族。前 3種受體相應(yīng)的配體分別為 FasL、TN F、APO-3L,后兩種配體均為 TRAIL。

1.2 細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑

細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑又稱為線粒體途徑,它由胞內(nèi)或胞外的凋亡刺激信號所激活,這些因素包括氧化應(yīng)激、輻射、DN A損傷以及細(xì)胞毒性藥物等[4]。與死亡受體依賴途徑不同,線粒體依賴途徑起始于線粒體膜:Bax/Bak蛋白插入線粒體膜,隨后線粒體內(nèi)膜釋放細(xì)胞色素 C進(jìn)入胞質(zhì)。釋放入胞質(zhì)的細(xì)胞色素 C被招募至凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)附近,組裝成一個二元復(fù)合物。在 ATP或 dAT P存在的情況下 pro-caspase-9即 caspase-9的前體物與細(xì)胞色素 C、Apaf1組裝成一個三元復(fù)合體,稱為凋亡體。大小約為700 kBa-1.4 mBa[5]。Pro-csapase-9通過它的 caspase募集結(jié)構(gòu)域 CARD與 Apaf1結(jié)合,兩分子的 csapase-9酶原相互剪切而活化?；罨?caspase-9作為線粒體依賴的凋亡途徑的起始者,隨后激活下游的凋亡執(zhí)行者 caspase-3,從而開啟蛋白水解的級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2 Caspases蛋白家族與凋亡

盡管細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不完全清楚,但是已有的研究表明 caspases即半胱氨酸蛋白酶是細(xì)胞凋亡過程中的核心環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟。

Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,它們的活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基,能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase-1是最早被發(fā)現(xiàn)的caspase家族蛋白,它與新桿狀線蟲中發(fā)現(xiàn)的能促進(jìn)凋亡的CED-3蛋白同源[7]。并非所有的 caspase都參與細(xì)胞凋亡過程,大多數(shù) caspase除參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行外 ,還參與到細(xì)胞存活、增值、分化或炎癥反應(yīng)等多個過程。

2.1 Caspase的活化機(jī)制

細(xì)胞中合成的 caspase在發(fā)揮活性之前以單鏈的無活性的酶原形式存在,包含四個結(jié)構(gòu)域:N端長度可變的prodomain區(qū),分子量分別為 20kD和10kD的大小亞基,以及連接兩個催化性亞基的鉸鏈區(qū)(有些家族成員中缺少鉸鏈區(qū) )。Caspase前體活化時,兩個大小亞基間的連接區(qū)被自身剪切,結(jié)果產(chǎn)生了由兩個大亞基和兩個小亞基組成的異源四聚體,即具有活性的酶。Caspase家族成員 N端 prodomain區(qū)長短不一,較長的 prodomain由至少90個氨基酸殘基組成,內(nèi)含能與接頭蛋白相互作用的調(diào)控區(qū),這些調(diào)控區(qū)具有 DED或 CARD功能域。DED-DED識別負(fù)責(zé)疏水蛋白相互作用,而 CARD-CARD接觸引發(fā)靜電相互作用。

根據(jù)其促凋亡功能,caspase蛋白家族分為兩類:一類為引發(fā)器(initiator),即凋亡的起始者,包括 caspases-2,-8,-9,-10,-11;另一類為效應(yīng)器(effector),或稱為凋亡執(zhí)行者,包括 caspases-3,-6,and-7。引發(fā)器 caspase在外來蛋白信號的作用下被切割激活,活化的引發(fā)器 caspase負(fù)責(zé)切割并激活下游的效應(yīng)器 caspase蛋白。效應(yīng)器 caspase蛋白能夠直接水解多種底物,包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞骨架中的結(jié)構(gòu)和調(diào)控蛋白[8]。在某些情況下,如凋亡起始信號較弱時,引發(fā)器 caspase也可以行使效應(yīng)器 caspase的功能,這將有助于放大凋亡信號。此外,效應(yīng)器 caspase也可以由其它的非 caspase蛋白酶激活,如組織蛋白酶、鈣蛋白酶和粒酶。這些 caspase蛋白水解信號級聯(lián)系統(tǒng)相互交聯(lián),最終導(dǎo)致凋亡信號被顯著放大。

2.2 Caspase抑制劑

由于 caspase在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,它們大多與癌細(xì)胞無限增殖密切相關(guān)。因此,有效控制 caspases的激活和抑制已成為癌癥治療的一個重要方向。

研究發(fā)現(xiàn),caspase蛋白家族在惡性腫瘤中發(fā)生突變的幾率較高[9]。在腫瘤細(xì)胞中,恢復(fù) procaspase-3表達(dá)能夠增加抗癌藥物敏感性。另一方面,通過反義 RN A阻斷一些caspase的表達(dá)能夠使腫瘤細(xì)胞對一些經(jīng)典的化療藥物敏感性增加。類似的工作有助于我們更好地理解 caspase級聯(lián)放大效應(yīng)的激活機(jī)制,從而為設(shè)計(jì)直接靶向 caspase激活機(jī)制而又不引起正常細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的的抗癌藥物研發(fā)帶來新的希望。

3 Smac在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

人類 Smac最初由王曉東實(shí)驗(yàn)室在 Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),位于第12條染色體的長臂,由7個外顯子組成。初始編碼的Smac由239個氨基酸組成,其氨基末端有一段特殊的由55個氨基酸殘基組成的序列,稱為線粒體靶向序列(mitochondrial targeting signal,M TS)。當(dāng)胞漿中的 Smac蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體后,MTS被剪切掉,生成含有184個氨基酸殘基的成熟蛋白,以二聚體的形式存在于線粒體膜間隙。在凋亡信號刺激下,成熟的 Smac/DABLO釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在胞質(zhì)中,Smac通過與 IAPs形成同二聚體而相互作用,促進(jìn) caspase活化,從而發(fā)揮促凋亡作用[11]。Smac能夠與 XIAP的 BIR2和 BIR3結(jié)構(gòu)域結(jié)合,使 XIAP無法發(fā)揮凋亡抑制作用,從而使得 caspase-3和 caspase-9得以釋放。其中,caspase-9的 N末端有一個與 Smac類似的四肽基序,因此能夠和 Smac競爭結(jié)合 XIAP的 BIR3結(jié)構(gòu)域;caspase-3的釋放則是 Smac的 N末端基序與 X IAP的 BIR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的緣故。

因?yàn)?Smac在腫瘤細(xì)胞化療敏感性方面扮演重要角色,所以對于 Smac表達(dá)水平是否與癌癥演進(jìn)過程呈負(fù)相關(guān)就顯得非常有必要,相關(guān)研究將為有望使 Smac成為癌癥預(yù)后或治療的靶標(biāo)。對腎細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn),Smac mRN A及蛋白表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展水平負(fù)相關(guān)[12]。此外,術(shù)后 Smac表達(dá)水平高的腎細(xì)胞癌患者生存時間也相應(yīng)高于 Smac低表達(dá)的患者;Smac低表達(dá)患者死亡概率要比高表達(dá)患者高四倍[13]。與此相似,Sekimura等在肺癌患者中也發(fā)現(xiàn)了 Smac表達(dá)水平明顯下降的現(xiàn)象[14]。由于非小細(xì)胞肺癌中 IAPs表達(dá)水平會上調(diào),因此 Smac表達(dá)降低將使得凋亡更難進(jìn)行。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),臨床三期患者 XIAP/Smac比值明顯高于一期和二期患者。

因此有望通過構(gòu)建表達(dá)成熟型 Smac的重組質(zhì)粒作用于肺癌患者,加入化療藥物紫杉醇作為凋亡誘導(dǎo)信號有望為肺癌的治療提供新的思路。

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