穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白細(xì)胞株構(gòu)建及附著力改變研究

劉 爽,魏 巍,張 輝,侯 杰,張淑紅,羅 蘭,范曉艷

(佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

腫瘤的侵襲性與轉(zhuǎn)移性是腫瘤惡性生物學(xué)行為,也是腫瘤難以徹底治愈的主要原因,隨著原發(fā)性惡性腫瘤治療療效的提高,生存期的延長,轉(zhuǎn)移性腫瘤在臨床上出現(xiàn)的頻率也在增加。因此國內(nèi)外研究人員對(duì)于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究一直是研究熱點(diǎn)。細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(Matrix Endocellular Phosphoglycoprot Ein,MEPE)是 2000年 Rowe PS等人最早在腫瘤源性骨軟化癥(tumor induced osteomalacia,TIO)的腫瘤中分離得到的,其定位于人的第4號(hào)染色體(4q21.1),認(rèn)為是一種腫瘤細(xì)胞分泌的磷酸化蛋白因子[1]。通常作為細(xì)胞基質(zhì)蛋白與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、附著及遷移能力密切相關(guān),本實(shí)驗(yàn)探討 MEPE蛋白對(duì)細(xì)胞附著能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株及載體

細(xì)胞株與質(zhì)粒 MEPE cDNA質(zhì)粒與 CHK1 cDNA質(zhì)粒,均由美國 EMORY大學(xué)王亞教授饋贈(zèng)。M RC5細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞研究所。質(zhì)粒 pLEGFP-N1為 BD Biosciences Clontech公司產(chǎn)品,大腸桿菌 E.coli DH5α由本室保存。

1.2 主要試劑

PCR產(chǎn)物純化采用 BIO101公司提供的 Geneclean II試劑盒(Cat#1001-400);質(zhì)粒提取采用 Qiagen公司 QIAprep質(zhì)粒提取試劑盒;Chk1抗體購自 Santa Cruz生物技術(shù)公司;ECL顯色系統(tǒng)購自 Amersham Biosciences公司;限制性內(nèi)切酶及 T4DN A連接酶購自 Takara生物公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔抗體購自中山生物技術(shù)公司。

1.3 儀器

PCR儀、UV-160紫外分析儀、半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)使用均在佳木斯大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.4 PCR擴(kuò)增、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及序列測(cè)定

由質(zhì)粒上擴(kuò)增出 MEPE cDN A全長,所用擴(kuò)增引物為:上游引物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′下游引物:3′-GGATCCTTACATT TGGGGGAGATG-3′PCR擴(kuò)增的目的基因經(jīng) Nde I與 BamH I雙酶切后,克隆到經(jīng)過同樣酶切處理的 pLEGFP-N1載體上,得到融合表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α,用含氨芐霉素的 LB培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜 ,挑取單克隆進(jìn)行 PCR篩選,選1～ 2個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序,鑒定序列及讀碼框架是否正確。

1.5 Western blotting檢測(cè)

收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,RIPA裂解,12% SDS-PAGE蛋白電泳,電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)印至 PV DF膜上,5%脫脂牛奶封閉過夜,1:500加入 M EPE或 CHK1抗體(鼠單抗)作為一抗,37°C溫育2h,TBST洗滌三遍,1:1000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗,37°C溫育1h,TBST洗滌三遍,用 ECL顯色系統(tǒng)使 X光片感光,獲得顯色條帶。

1.6 附著力檢測(cè)

采用含10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)基在37℃,5%CO2,飽和濕度的細(xì)胞孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長期,0.25%胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞,鋪96孔板,1h后吸棄上清,PBS清洗2次,臺(tái)盼藍(lán)染色后立即計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中相應(yīng)的外源基因呈現(xiàn)高表達(dá)(見圖1)。轉(zhuǎn)染 M EPE與 MEPE/CHK1的細(xì)胞株附著力明顯增加(見圖 2)。

圖1 穩(wěn)定表達(dá) M EPE-HA與 CHK1的細(xì)胞株 Western印跡鑒定結(jié)果

圖2 各細(xì)胞株附著力檢測(cè)結(jié)果

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白屬于 SIBLINGs家族成員。在正常生理情況下與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞功能密切相關(guān),因?yàn)镾IBLINGs家族成員都含有 RGD序列,可以與細(xì)胞表面受體蛋白結(jié)合參與細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)通路,導(dǎo)致生物力學(xué)改變,與細(xì)胞遷移能力有密切關(guān)系。近幾年來,越來越多的報(bào)道顯示 SIBLINGs家族成員與腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段包括增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成都相關(guān)[2,3]。本實(shí)驗(yàn)組早期致力于研究細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白與細(xì)胞抗輻射性關(guān)系,發(fā)現(xiàn)其在輻射耐受細(xì)胞中高表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞株中 M EPE蛋白表達(dá)量增高會(huì)提高細(xì)胞附著能力,并且與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白 CHK1有相輔相成的作用,提示我們 M EPE蛋白與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

[1] Rowe PS,Zoysa PA,Dong R,et al.M EPE,a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J].Genomics,2000,67(1):54-68

[2] Bellahcene A,Castronovo V,Ogbureke KE,et al.Small integrinbinding N-linked Glycoproteins(SIBILIN Gs):multifunctional protein in cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,8(3):212-226

[3] Fisher LW,Fedarko NS.Six genes expressed in bones and teeth encode the current members of the SIBLING family of proteins[J].Connect Tissue Res,2009,44(Suppl1):33-40