蛋白質組學在肺癌與肺結核病鑒別診斷中的研究進展

張雙林，孫明飛，宋言崢

（1.河南大學第一附屬醫(yī)院 胸心血管外科，河南 開封 475000；2.復旦大學 附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 200540）

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。近年來，發(fā)病率在世界各國呈上升趨勢，其病死率位居惡性腫瘤首位。由于HIV傳播及抗生素耐藥率不斷上升，肺結核病在全球死灰復燃。肺結核、肺癌都屬于呼吸系統(tǒng)疾病，具有相似的臨床癥狀。目前，肺結核特別是菌陰肺結核與肺癌的鑒別診斷仍是一大難題?，F(xiàn)有的鑒別診斷方法很多，但效果不一，都存在局限性。蛋白質組學技術的出現(xiàn)及其發(fā)展為2種疾病的診斷標志物的研究提供了新的方法及思路，未來可能為2種疾病的診斷及鑒別診斷提供新的技術手段。

1 蛋白質組學概念及研究內容

1994年澳大利亞的 Wikins和 Williams［1］在意大利提出了蛋白質組（proteome）這一概念，其意指“一種基因組所表達的全套蛋白質，即包括一種細胞、一種組織全部蛋白質”。它的最大優(yōu)勢是可以在同一個實驗中，觀察一個完整的蛋白質或蛋白質亞型在特定的時間下，生理或病理狀態(tài)中所發(fā)生的相應的變化［2］。近年來，隨著蛋白質組學技術的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)一批有價值的潛在標志物，為疾病的診斷和治療開辟了新的途徑［3-4］。

蛋白質組學的主要研究內容是：①表達蛋白質組學：即研究蛋白質表達質與量的變化，以及對蛋白質表達圖譜的分析研究。②功能蛋白質組學：即研究蛋白質在細胞內的行為、運輸以及蛋白質相互作用的網絡關系。③結構蛋白質組學：為了闡述蛋白質的結構特征，而出現(xiàn)的一種全景式的蛋白質組學研究，可獲得有機體生命活動的全景式認識。蛋白質組學的深入研究能更深入地了解疾病發(fā)生的分子機制，同時也能為疾病的預防、臨床診斷及治療提供新思路。

2 蛋白質組學常用技術

2.1 蛋白質樣品制備

蛋白質樣品制備至今沒有一個通用的技術。在制備樣品時，首先要明確實驗的最終目的，然后結合實驗積累的經驗來選取制備方法。

蛋白質樣品制備的原則：①制備的樣品要全部處于溶解狀態(tài)。②在制備樣品時防止發(fā)生聚集、沉淀。③完全去除干擾蛋白（高豐度及無關蛋白）。④制備方法要具有可重復性。而制備蛋白質樣品的同時要特別注意去除高豐度蛋白（血清蛋白、免疫球蛋白、轉鐵蛋白、珠蛋白、脂蛋白等）［5］。去除高豐度蛋白方法很多，應根據(jù)實驗目的選取。例如：親和層析技術［6］、沉淀法［7］、超濾離心法［8］、等電捕捉法［9］、液相色 譜法［10］等。而理想的去除高豐度蛋白的方法是：既能最大限度地去除高豐度蛋白又能避免影響低豐度蛋白。因此，要根據(jù)不同的實驗及其目的選擇不同的方法。

2.2 雙向凝膠電泳（two－dimensional gel electrophoresis，2－DE）

雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的經典方法之一。1975年，O’Farrell［11］首次建立等電聚焦／SDS－聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳（IEF／SDS－PAGE）的模式，其基本原理為，第一向電泳：蛋白質在pH梯度內按照它們等電點的不同進行分離；第二向電泳：在垂直方向上按照蛋白質的相對分子質量大小進行SDSPAGE電泳分離。直到20世紀80年代中期出現(xiàn)了“固相pH梯度”，克服了載體兩性電解質陰極漂移、梯度不穩(wěn)定等缺點，從而大大提高了分辨率。但是，2－DE依然存在缺陷：①分離蛋白質數(shù)目遠遠小于人類基因組數(shù)所表達蛋白質。②不易分離分子量大于200KD或小于10KD的蛋白質。③不易分離疏水蛋白、膜蛋白、低豐度蛋白。④不易分離極酸或極堿蛋白。所以 “2－DE是否已過時？”也反復的被提出。迄今，許多人努力尋找替代2－DE的方法，促進了其他的蛋白質分離、分析技術的出現(xiàn)。例如：“液相色譜技術”在一定程度上克服了2－DE的缺陷，與2－DE比較，液相色譜技術在對分離疏水蛋白及膜蛋白等方面上具備獨特的優(yōu)勢［12］。然而這種技術卻不足以替代具有高分辨能力的、成熟技術路線的2－DE。

總的來講，鑒于蛋白質的豐度和性質的多樣性，不可能僅用一種分離技術就能應對所有的蛋白質組分析的需求。因此，多項技術互補性應用在蛋白質組學的研究中不可忽視。

2.3 質譜技術

1912年，英國物理學家Joseph John Thomson研制出第一臺質譜儀。但直到20世紀40年代，質譜技術才廣泛應用于有機物質的分析。20世紀80年代“四大軟電技術”的出現(xiàn)，讓質譜技術從此邁入生物質譜時代。常用的質譜技術主要有：①電噴霧質譜技術（ESI－MS）［13］：基本原理是毛細管出口處所產生的高壓把毛細管流出的液體霧化成帶電荷的小液滴。隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面電荷強度越來越大，最終液滴變成帶有大量一個或者多個電荷的離子，致使分析物質以電荷形式進入氣相。其特點為，通過產生的高電荷離子，使質量／電荷降低到多數(shù)質量分析儀器可以檢測的范圍，所以ESI－MS大大提高了分析范圍。②基質輔助激光解吸吸附質譜技術（MALDIMS）［14］：基本原理是將分析的物質分散在基質分子中并形成晶體。當用激光照射晶體時，由于基質分子經輻射吸收大量的能量，基質分子因能量蓄積而迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分析物膨脹并進入氣相。MALDI常與TOF聯(lián)合使用，而TOF可檢測的分子質量沒有上限，因此，MALDI－TOFMS適合對核酸、多肽、蛋白質及多糖的檢測。③表面增強激光解析離子化／飛行時間質譜技術（SELDITOF－MS）：該技術是由 MALDI－TOF發(fā)展而來的，是一項蛋白芯片技術。其基本原理是待測樣品與有廣泛結合特性的芯片結合，然后直接進入MALDITOF的檢測。它的開展解決了以往蛋白質研究中費力、耗時、不適合臨床大規(guī)模篩查的弊端。

目前質譜技術已成為測定生物大分子（蛋白質、多肽、多糖等）的有效工具，也是蛋白質組學的核心技術之一［15］。

3 肺癌與肺結核的蛋白質組學研究進展

隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，肺癌與肺結核的診斷及鑒別診斷無論從方法多樣性或檢出率上都有了很大的改觀。但至今仍未找到一種快速、特異、廉價、高效的方法去鑒別兩種疾病。目前只能靠多種檢查來綜合判定，最可靠的方法是病理組織活檢及細菌學檢查。然而病理組織活檢創(chuàng)傷較大、細菌學檢查時間長，檢出率低等，都直接制約了兩種疾病的鑒別效果，同時也阻礙了臨床早期治療。近年來，蛋白質組學的出現(xiàn)及發(fā)展，為兩種疾病的研究提供了新的平臺。從蛋白質水平揭示兩種疾病的相關性及差異性，為兩者的鑒別診斷研究奠定了基礎。

3.1 蛋白質指紋圖譜診斷模型的鑒別診斷價值

蛋白質指紋圖譜診斷模型是最佳的蛋白峰組合，其檢測靈敏度、特異度都要高于單一蛋白質診斷效率，具有一定的診斷及鑒別診斷價值，對肺癌及肺結核的診斷及鑒別診斷有著潛在的研究價值。王琳等［16］收集肺結核、肺癌患者及正常人的血清標本各65例，采用WCX2芯片技術對血清蛋白進行捕獲，用蛋白芯片閱讀器PBSⅡ對芯片進行分析比較，65例活動性肺結核與65例肺癌患者的血清蛋白質譜數(shù)據(jù)顯 示：4 個 蛋 白 峰 （5335m／z、8048m／z、11700m／z、11683m／z）傾向于肺結核（P＜0.01），該診斷模型判別的總準確率為74.6% （97／130），靈敏度80.0%（52／65），特異度69.2% （45／65）。而Liu等［17］收集了87位結核病患者（51位涂片陽性、36位涂片陰性）、68位非結核病患者（55位健康人、13位其他呼吸系統(tǒng)疾?。?，用SELDI－TOF－MS分離血清蛋白質，并得到血清蛋白質的指紋圖譜，最終選定9個質譜峰建立診斷模型，并對測試組檢測，診斷準確率為80%；聚類分析顯示：m／z 4821.45，4792.74分辨涂片陰性結核患者和對照組的準確度為81.59%。

3.2 標志物的鑒別診斷價值

標志物的檢測具有快速、高效、廉價等優(yōu)點，可提高臨床診斷的效率，也是鑒別診斷的理想指標。利用蛋白質組學技術尋找疾病特異的標志物，可為研究疾病的早期診斷及兩種疾病的鑒別診斷提供新的思路。

Liu等［18］對227例血清樣品（146例肺癌、13例肺炎、28例結核性胸膜炎和40例正常人血清樣品）進行蛋白質譜檢測，鑒定出3個能把肺癌組與肺炎組、結核性胸膜炎組、正常人組區(qū)分開來得差異蛋白。質譜鑒定這3個差異蛋白峰分別為“野生型甲狀腺運載蛋白”以及它的兩個變體。Chen［19］運用蛋白組學技術對“非小細胞肺癌細胞系NCL－H266”和“腦轉移細胞系 H226BR”的分泌蛋白對比研究中，發(fā)現(xiàn)了LDHB在非小細胞肺癌患者血清中的表達水平遠遠高于結核患者、肺炎患者和正常人的血清中的表達水平。林全［20］通過2－DE、MALDI－TOF－MS對癌性胸腔積液及結核性胸腔積液的差異蛋白進行了比較研究，其中有9個點僅在結核性胸腔積液表達，11個點僅在肺癌胸腔積液中表達，最終選取差異顯著的10個點進行質譜分析，成功鑒定了6個蛋白質。Rodriguez－Pineiro等［21］利用2－DE和質譜技術分別從“非小細胞肺癌和肺炎病人的血清水平”、“非小細胞肺癌和肺結核病人的胸腔積液水平”進行研究，發(fā)現(xiàn)PEDF在非小細胞肺癌患者的血清和胸腔積液中的表達高于結核患者與肺炎患者組；而凝溶膠蛋白和金屬蛋白酶抑制劑2在非小細胞肺癌的胸腔積液中表達高于結核患者胸腔積液、S100－A8和S100－A9在非小細胞肺癌的胸腔積液中處于低表達。He等［22］應用蛋白質組學方法發(fā)現(xiàn)了一種新的非小細胞肺癌的腫瘤抗原α－烯醇酶，并聯(lián)合ELISA方法檢測α－烯醇酶的自身抗體，發(fā)現(xiàn)α－烯醇酶在非小細胞肺癌組中自身抗體陽性率較高，為27.65%。而其他肺部疾?。òńY核?。﹥H在正常對照組發(fā)現(xiàn)了1例。

4 展望

在同一疾病不同發(fā)展階段或不同疾病，其蛋白質表達往往存在差異，這些差異蛋白可能與該疾病的發(fā)生和發(fā)展有直接或間接的關系［23］，也可根據(jù)這些差異蛋白對疾病進行診斷及鑒別診斷［24］。目前，在蛋白組學水平上對兩種疾病的鑒別診斷研究還較少。但是，不論那種疾病的特異性標志物的發(fā)現(xiàn)都將會對兩種疾病的診斷及鑒別診斷做出巨大貢獻。如今蛋白質組學已被廣泛應用于各種疾病及同一疾病不同層面的研究。未來對肺癌及肺結核的鑒別診斷研究將會成為新的研究方向，也必將為兩種疾病的診斷和個體化治療提供新型技術手段。

［1］Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa－Poljak A，Yan JX，Gooley AA，Wilkins MR，Duncan MW，Harris R，Williams KL，Humphery－Smith I：Progress with gene－product mapping of the Mollicutes：Mycoplasma genitalium［J］.Electrophoresis，1995，16（7）：1090－1094.

［2］Chao TC，Hansmeier N，Halden RU：Towards proteome standards：the use of absolute quantitation in highthroughput biomarker discovery［J］.J Proteomics，2010，73（8）：1641－1646.

［3］Hanash SM，Baik CS，Kallioniemi O：Emerging molecular biomarkers－blood－based strategies to detect and monitor cancer［J］.Nat Rev Clin Oncol，2011，8（3）：142－150.

［4］Luo X，Liu Y，Wang R，Hu H，Zeng R，Chen H：A high－quality secretome of A549cells aided the discovery of C4b－binding protein as a novel serum biomarker for non－small cell lung cancer［J］.J Proteomics，2011，74（4）：528－538.

［5］Thadikkaran L，Siegenthaler MA，Crettaz D，Queloz PA，Schneider P，Tissot JD：Recent advances in blood－related proteomics［J］.Proteomics，2005，5（12）：3019－3034.

［6］Azar kan M HJ，Baeyens－Volant D：Affinity chromatography：auseful tool in proteomics studies［J］.J Chromatogr B，2007，849（1－2）：81－99.

［7］Polaskova V，Kapur A，Khan A，Molloy MP，Baker MS：High－abundance protein depletion：comparison of methods for human plasma biomarker discovery［J］.Electrophoresis，2010，31（3）：471－482.

［8］Tirumalai RS，Chan KC，Prieto DA，Issaq HJ，Conrads TP，Veenstra TD：Characterization of the low molecular weight human serum proteome［J］.Mol Cell Proteomics，2003，2（10）：1096－1103.

［9］Herbert B，Righetti PG：A turning point in proteome analysis：sample prefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes［J］.Electrophoresis，2000，21（17）：3639－3648.

［10］李煥敏，邵明，譚紅愉：腦脊液蛋白質組學高豐度蛋白去除方法的建立與評價.現(xiàn)代臨床醫(yī)學生物工程學雜志［J］，2007，13（2）：49－69.

［11］O＇Farrell PH：High resolution two－dimensional electrophoresis of proteins［J］.J Biol Chem，1975，250（10）：4007－4021.

［12］de Godoy LM，Olsen JV，Cox J，Nielsen ML，Hubner NC，F(xiàn)rohlich F，Walther TC，Mann M：Comprehensive mass－spectrometry－based proteome quantification of haploid versus diploid yeast［J］.Nature，2008，455（217）：1251－1254.

［13］Bakhtiar R，Nelson RW：Electrospray ionization and matrix－assisted laser desorption ionization mass spectrometry.Emerging technologies in biomedical sciences ［J］.Biochem Pharmacol，2000，59（8）：891－905.

［14］Gevaert K，Vandekerckhove J：Protein identification methods in proteomics［J］.Electrophoresis，2000，21（6）：1145－1154.

［15］Cravatt BF，Simon GM，Yates JR，3rd：The biological impact of mass－spectrometry－based proteomics［J］.Nature，2007，450（71）：991－1000.

［16］王琳，翁麗珍，李學玲等：蛋白質指紋圖譜技術在肺結核、肺癌鑒別診斷中的應用研究.中國防癆雜志［J］.2011，33（04）：182－187.

［17］Liu Q，Chen X，Hu C，Zhang R，Yue J，Wu G，Li X，Wu Y，Wen F：Serum protein profiling of smear－positive and smear－negative pulmonary tuberculosis using SELDITOF mass spectrometry［J］.Lung，2010，188（1）：15－23.

［18］Liu L，Sun S，Liu J，Wu S，Dai S，Wang X，Huang L，Xiao X，He D：［A new serum biomarker for lung cancertransthyretin.［J］.Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2009，12（4）：300－305.

［19］Chen Y，Zhang H，Xu AJ，Liu JF，Li N，Wu SS，Huang LY，He DC，Xiao XY：［Identification and clinical evaluation of lung cancer serum biomarker L－lactate dehydrogenase B］.Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2007，30（8）：577－581.

［20］林全，王良興，金旭日，施孟如：肺癌性與結核性胸腔積液蛋白質組的差異［J］.溫州醫(yī)學院學報2011，41（3）：245－248.

［21］Rodriguez－Pineiro AM，Blanco－Prieto S，Sanchez－Otero N，Rodriguez－Berrocal FJ，de la Cadena MP：On the identification of biomarkers for non－small cell lung cancer in serum and pleural effusion［J］.J Proteomics，73（8）：1511－1522.

［22］He P，Naka T，Serada S，F(xiàn)ujimoto M，Tanaka T，Hashimoto S，Shima Y，Yamadori T，Suzuki H，Hira shima T et al：Proteomics－based identification of alphaenolase as a tumor antigen in non－small lung cancer［J］.Cancer Sci，2007，98（8）：1234－1240.

［23］Schramm A，Apostolov O，Sitek B，Pfeiffer K，Stuhler K，Meyer HE，Havers W，Eggert A：Proteomics：techniques and applications in cancer research［J］.Klin Padiatr，2003，215（6）：293－297.

［24］Poon TC，Johnson PJ：Proteome analysis and its impact on the discovery of serological tumor markers［J］.Clin Chim Acta，2001，313（1－2）：231－239.