體外去SUMO化體系的建立及應(yīng)用

王岳飛

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，上海 200025）

體外去SUMO化體系的建立及應(yīng)用

王岳飛

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，上海 200025）

目的構(gòu)建體外去SUMO化系統(tǒng)用于藥物篩選。方法大腸桿菌表達(dá)人Senp2催化活性結(jié)構(gòu)域即Senp2C和SUMO1化的RanGAP1△C。結(jié)果Ni2＋柱純化獲得有活力的酶Senp2C和底物蛋白質(zhì)即RanGAP1△C－SUMO1。結(jié)論建立體外去SUMO化系統(tǒng)，可篩選影響去SUMO化活性的藥物。

Senp2；SUMO1；去SUMO化；藥物篩選

小泛素相關(guān)修飾因子（small ubiquitin－related modifien，SUMO）化修飾是蛋白質(zhì)翻譯修飾的一種重要形式。成熟形式的SUMO通過特定的SUMO化酶的作用，SUMOs的甘氨酸尾巴可以和被修飾蛋白質(zhì)特定位置上賴氨酸殘基的ε－氨基連接形成異肽鍵，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行 SUMO 化修飾［1－3］。目前為止，研究發(fā)現(xiàn)可以被SUMO化修飾的蛋白質(zhì)已經(jīng)有很多，這些蛋白質(zhì)有2／3是轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子的輔因子。除轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能外，另外發(fā)現(xiàn)的SUMO化蛋白質(zhì)還有參與發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、蛋白質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體生成、DNA 修復(fù)等生理進(jìn)程［4－6］。

SUMO化修飾在體內(nèi)是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，SUMOs首先是被切除羧基末端多余氨基酸序列露出Gly－Gly尾巴，然后被連接到靶蛋白質(zhì)上形成SUMO化的目標(biāo)蛋白質(zhì)，最后SUMO又可以從被修飾的靶蛋白質(zhì)上完整的切除下來。由此形成SUMO化／去SUMO化的循環(huán)。在此循環(huán)調(diào)控中，一類稱為SENPs（Sentrin－specific proteases，SENPs）的蛋白酶行使著重要的功能：①切除SUMO前體C－末端的幾個(gè)氨基酸殘基，以暴露c－末端的雙Gly殘基使之成為具有修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能的成熟SUMO。②將SUMO－底物蛋白質(zhì)復(fù)合物水解成SUMO和底物，這個(gè)過程稱為去SUMO化。哺乳動(dòng)物中SENPs家族由6個(gè)成員組成，它們都屬于半胱氨酸蛋白酶家族，Senp2（Sentrin－specific protease 2，Senp2）就是其中的一種，它能夠催化大量蛋白質(zhì)去SUMO化，同時(shí)具有極高的內(nèi)肽酶活性（使SUMOs成熟）［7－8］。

對(duì)于SENPs酶活性（內(nèi)肽酶、異肽酶）的研究有不少的報(bào)道，也有多種的檢測(cè)體系。我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用原核表達(dá)SUMO化的蛋白質(zhì)和Senp2催化活性結(jié)構(gòu)域，建立體外去SUMO化體系，研究體外條件下對(duì)Senp2C的異肽酶活力可能有影響的藥物分子或小分子化合物［9－10］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a購自Novagen公司；RanGAP1△C－SUMOI表達(dá)質(zhì)粒由程金科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株購自Tiangen公司。

1.1.2 主要試劑 高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)均購自TaKaRa公司；Ni－NTA Agarose親和柱購自Qiagen公司；質(zhì)粒提取試劑盒和核酸回收試劑盒購自Sangon公司；異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（Isopropy－β－D－thiogalactoside，IPTG）購自生物工程（上海）有限公司；小牛血清白蛋白（BSA）、咪唑（imidazole）、二硫蘇糖醇（DTT）、氨芐青霉素、苯甲基磺酰氟（Phenylmethyl sufonyl fluoride，PMSF）均購自碧云天公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自Sigma公司；其他試劑均均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 AKTA－purifier購自 GE公司；Bio－Rad凝膠電泳系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白質(zhì)的表達(dá)純化 以前列腺癌細(xì)胞系PC3細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到人SENP2包含催化活性結(jié)構(gòu)域（Catalytic domain，SENP2C）的截短體（360～589aa）編碼序列。兩端用Nde I和Sal I限制性酶切后與同樣雙酶切的pET28a載體連接，構(gòu)建pET28a－SENP2C表達(dá)質(zhì)粒，用于表達(dá)N－端帶6His－tag的SENP2C。

pET28a－SENP2C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌 BL21（DE3）菌株，挑單克隆轉(zhuǎn)接到10mL LB培養(yǎng)液中，37℃，300r／min，擴(kuò)增菌液過夜（15h），然后按照1∶100比例轉(zhuǎn)接到1LLB培養(yǎng)液中，37℃，300r／min，擴(kuò)增菌液至OD600在0.8左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2mmol／L，27℃，260r／min，振蕩培養(yǎng)5h，誘導(dǎo)SENP2C表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌液，菌體稱濕重后于－80℃存放備用。純化方法采用普通Ni柱非變性純化過程，詳見Qiagen公司技術(shù)手冊(cè)。

SUMO化的RanGAP1△C的表達(dá)參考文獻(xiàn)［11］的方法，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，卡那霉素與氯霉素雙抗性LB平板篩選得到含2種質(zhì)粒的單克隆，轉(zhuǎn)接到20mL LB培養(yǎng)液中，37℃，300r／min，擴(kuò)增菌液過夜培養(yǎng)，然后按照1∶100比例轉(zhuǎn)接到2LLB培養(yǎng)液中，37℃，300r／min，擴(kuò)增菌液至 OD600大于 1.0 時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2mmol／L，25℃，260r／min，振蕩培養(yǎng)12h。誘導(dǎo)完畢后離心收集菌體，用常規(guī)Ni－NTA親和層析獲得SUMO1化的RanGAP1△C。因其中混雜未被SUMO1修飾的RanGAP1△C，所獲SUMO1化蛋白質(zhì)僅占Ni柱純化樣品的50%左右，所以用FPLC進(jìn)行2次純化。把Ni柱純化得到的樣品用Amicon Ultra 15超濾濃縮管濃縮置換緩沖液，上樣置1mL的MonoQ柱子，A液為pH 8.0的20mmol／L Tris－HCl，B液為pH 8.0的20mmol／L Tris－HCl和1mol／L NaCl，0～0.8mol／L NaCl線性梯度洗脫。分別收集各洗脫峰，SDS－PAGE電泳檢測(cè)SUMO化RanGAP1△C（40KDa）所在組分，Amicon濃縮后用體積分?jǐn)?shù)為50%甘油－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Senp2C異肽酶活性（去SUMO化檢測(cè)） 去SUMO化反應(yīng)條件為：50μL體系，25mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，150mmol／L NaCl，1mmol／L DTT，8μg SUMO化的RanGAP1△C底物和5nmol／L Senp2C，37℃，1.5h。反應(yīng)完畢后加入12.5μL 5×的SDS－PAGE上樣緩沖液，95℃加熱5min中止反應(yīng)。然后SDS－PAGE電泳樣品，考馬斯亮藍(lán)染色PAGE膠顯示樣品蛋白質(zhì)條帶，脫色后掃描儀將染色后的PAGE膠成像，用Bio－Rad Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，計(jì)算SUMO化底物的消耗量及酶活力。

1.2.3 化合物抑制Senp2C去SUMO化活力檢測(cè)去SUMO化反應(yīng)條件為條件和檢測(cè)方法同“1.2.2”項(xiàng)下，唯一不同的是在每個(gè)反應(yīng)體系中加入一定濃度的待測(cè)小分子化合物。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆和表達(dá)純化

SENP2C編碼序列681個(gè)核苷酸序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證插入pET28a質(zhì)粒正確，經(jīng)小量表達(dá)測(cè)試表明可以在大腸桿菌中正確表達(dá)有活力的Senp2C蛋白質(zhì)。大量表達(dá)Ni柱親和純化后獲得10g／L的Senp2C共1.5mL。見圖1。

2.2 去SUMO化活力分析

按“1.2.2”項(xiàng)下方法，37℃，50μL體系中，分別加入不同濃度的Senp2C，反應(yīng)1.5h，結(jié)果見圖2。圖2中，在Senp2C的作用下，40kDa的RanGAP1△C－SUMO1被蛋白酶切割成25kDa的RanGAP1△C和15kDa的SUMO12個(gè)肽段?？梢姶梭w外去SUMO化體系可以用于Senp2C活力檢測(cè)以及篩選對(duì)Senp2C活力有影響的藥物分子。

圖1 SDS－PAGE檢測(cè)重組表達(dá)純化的蛋白質(zhì)

圖2 去SUMO化活力檢測(cè)

2.3 小分子化合物對(duì)Senp2C異肽酶活力的影響

按照去SUMO化反應(yīng)條件，選擇了部分小分子化合物加入去SUMO化反應(yīng)體系中檢測(cè)其對(duì)Senp2C活力的影響，結(jié)果見圖3。因?yàn)樾》肿踊衔锒既苡贒MSO中，故把DMSO也作為一種化合物單獨(dú)加入一個(gè)反應(yīng)體系以作為對(duì)照（泳道4），同時(shí)也使用了非特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑作為陽性對(duì)照（泳道5）。通過與對(duì)照反應(yīng)體系的比較可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的4個(gè)化合物（泳道6～9）中，1號(hào)化合物對(duì)Senp2C的去SUMO化活力有明顯抑制作用，而其他3個(gè)化合物沒有抑制作用。據(jù)此我們可以對(duì)1號(hào)化合物做更深入的實(shí)驗(yàn)分析。

圖3 小分子化合物對(duì)Senp2C異肽酶活力影響

3 結(jié)論

SUMO化—去SUMO化的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于調(diào)控細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)具有極其重要的作用，在體內(nèi)，這是一個(gè)受到精確調(diào)控的過程。通過體外表達(dá)純化獲得Senp2C及RanGAP1△C－SUMO1，建立檢測(cè)去SUMO化反應(yīng)體系，在一定程度上可以模擬體內(nèi)的去SUMO化過程，為我們研究體內(nèi)的去SUMO化過程提供一個(gè)間接的手段。實(shí)驗(yàn)中我們獲得了高純度、高活力的去SUMO化酶Senp2C，也得到了酶作用的底物蛋白質(zhì)SUMO 1化的RanGAP 1△C。通過不同實(shí)驗(yàn)條件的組合對(duì)比得到了合適的體外去SUMO化反應(yīng)條件，在此體外條件下對(duì)Senp2C異肽酶活力有影響的小分子化合物進(jìn)行篩選，獲得了一些初步的數(shù)據(jù)。通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，體外去SUMO化體系既可以用于基礎(chǔ)研究，也能用于一些有針對(duì)性的藥物開發(fā)。

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［責(zé)任編輯 姬 荷］

Establishment and application of an in vitro desumoylation system

WANG Yue－fei（Department of Pathophysiology，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200025，China）

ObjectiveTo set up in vitro desumoylation system and use it to drug screening.MethodsSenp2Cwas produce and SUMO－1－conjugated protein RanGAP1△C in Escherichia coli.ResultsRecombinant proteins were purified by Ni2＋columns.ConclusionIn vitro desumoylation system is established successful and it can used in drug screening.

Sentrin－specific protease 2；SUMO－1；Desumoylation；Drug Screening

Q78

A

1672－7606（2012）02－0121－03

2012－02－10

王岳飛（1978－），男，江西上饒人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，從事病理生理學(xué)的教學(xué)與科研工作。