兒科多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵基因表達及其危險因素分析

史桂梅 鐘紅平 劉世平

銅綠假單胞菌(psedom onas aeruginas，Pa)是目前難治性醫(yī)院感染的主要致病菌，主要原因是Pa多重耐藥(multidrug－resistance，MDR)株不斷出現(xiàn)［1］。耐藥結節(jié)細胞分化家族(resistance nodulation cell division family，RND)是細菌外排泵系統(tǒng)之一，在Pa的多重耐藥中起著重要作用［2，3］。本文探討多藥耐藥Pa的9種外排泵系統(tǒng)表達的分布趨勢及其感染危險因素，為臨床防治銅綠假單胞菌多重耐藥的產(chǎn)生提供理論支持。

材料與方法

1.菌株來源:收集2008年1月～2010年12月筆者醫(yī)院兒科多重耐藥Pa感染病例97例。年齡為出生后7天～12歲，平均年齡7.8歲，其中痰標本37例，血標本29例，創(chuàng)面標本18例，導管標本8例，其他標本5例，菌株均經(jīng)VITEK－Am s60全自動細菌鑒定系統(tǒng)和常規(guī)生化檢測鑒定。

2.主要儀器試劑:熒光定量PCR儀、電泳儀、核酸蛋白分析儀、低溫高速離心機、凝膠成像分析系統(tǒng)。TRIzol RNA提取液，Prime Script RT reagent Kit Perfect Real time試劑盒及Premix Taq Version 2.0，ABI7500熒光定量專用96孔板，瓊脂糖，異丙醇，三氯甲烷，無水乙醇等分析純。

3.實驗方法:(1)細菌處理:收集臨床標本培養(yǎng)的多重耐藥Pa株，先用LB培養(yǎng)基搖菌增菌，后加入無菌甘油(20%終濃度)，－80℃冰箱保存待用。(2)基因檢測:1)引物設計:參考文獻進行PCR引物設計，所有PCR產(chǎn)物(＞150bp)進行雙向測序，所測各基因序列與Pubmed數(shù)據(jù)庫中相關基因進行Blast比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)［4～8］。2)細菌總RNA提取、cDNA的合成及反轉錄反應:LB培養(yǎng)基搖菌增菌，后加入無菌甘油，－80℃冰箱保存待用。提取總RNA之前置于冰上復溫，然后接種于LB培養(yǎng)基中，240r/min，37℃振搖16～18h，取菌液3ml，4000r/min，離心3min，棄上清，加1m l TRIzol RNA提取試劑盒，按說明步驟提細菌總RNA，然后行凝膠電泳測RNA完整性，選擇3條帶清晰，A260/ A280=1.8～2.0的細菌總RNA行反轉錄反應，按試劑盒說明操作。3)PCR分析目的基因的表達:Pa菌株總cDNA進行PCR反應，每株菌均設rpsL為內(nèi)參，反應產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100V 5min，然后凝膠電泳成像儀拍照保存。4)realtime－PCR半定量分析目的基因的表達:反應體系:SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)10.0μl，熒光定量PCR上下游引物(10μmol/L)各1μl，ROX Reference Dye or DyeII(50×)0.4μl，RT反應液(cDNA溶液)1.0μl，滅菌雙蒸水補至20μl體系，ABI7500分析。分析方法采用2－ΔΔCT法半定量分析各基因表達量，重復3次計算結果。

結果

1.多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥情況:具體見表1。

表1 多重耐藥Pa藥敏結果［n(%)］

2.各外排基因的表達情況:MexAB－OprM均表達(97/97)，MexEF－Op rN表達陽性率51.5%(50/ 97)，MexCD－OprJ為36.1%(35/97)，MexVMOprM為11.3%(11/97)，其他少見外排泵系統(tǒng)表達均較低，詳見圖1。

圖1 9種Pa外排泵基因表達陽性率其中3種外排泵基因高表達散點圖

3.多重外排泵基因表達分析:同時表達2種外排泵的有23株，占23.7%，MexAB－OprM與MexEFOprN組合(15株)，MexCD－OprJ與MexEF－OprM組合(7株)，MexXY－OprM與MexMN－OprM(1株)組合為主，未見其他組合;同時表達3種外排泵的有7株，占7.2%，主要以MexAB－OprM+MexEFOprN+MexXY－OprM組合，未見其他組合。

4.外排泵基因表達或高表達的危險因素分析:具體見表2、表3。

表2 銅綠假單胞菌主要多重耐藥外排泵表達的危險因素單因素分析［n(%)］

表3 銅綠假單胞菌3種常見多重耐藥外排泵表達或高表達的危險因素多因素Logistic回歸分析

討論

銅綠假單胞菌隸屬非發(fā)酵菌假單胞菌屬，是一種重要的條件致病菌，也是引起院內(nèi)感染的重要病原菌［9］。Pa耐藥機制復雜，耐藥結節(jié)細胞分化家族的主動外排泵系統(tǒng)在Pa多重耐藥機制中起主導作用［10］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種Pa的外排泵系統(tǒng)，不同外排泵的表達導致細菌耐藥譜各異。因此，研究各種外排泵表達的分布，對臨床抗感染治療有重要指導作用。本研究發(fā)現(xiàn)，MexAB－OprM在所有多重耐藥Pa菌株中均表達，其高表達也達到44.3%，其次是Mex-EF－OprN(51.5%)，MexCD－OprJ(36.1%)，MexVM－OprM(11.3%)，除MexJK－OprM未發(fā)現(xiàn)之外，其他外排泵表達均較低，此外還存在多種外排泵系統(tǒng)組合表達的情況。而臨床分離的敏感菌株中，除Mex-AB－OprM均低水平表達外(資料未顯示)，未見其他外排泵系統(tǒng)的表達，說明各種外排泵的表達與菌株對抗生素的耐藥存在相關性，與國內(nèi)報道一致［11］。由于存在不同外排泵系統(tǒng)的組合表達，導致耐藥的復雜和廣泛化，使得臨床治療藥物選擇受限。

Pa外排泵系統(tǒng)的表達，部分是由于抗生素誘導而產(chǎn)生的。Kolayli等研究發(fā)現(xiàn)碳青酶烯類抗生素亞胺培南可以誘導Pa表達MexAB－OprM增高，但丁兆勇等［12］研究發(fā)現(xiàn)亞胺培南、環(huán)丙沙星對Pa浮游菌及生物膜菌的MexAB－OprM無誘導作用，因此需進行更大樣本的研究。本研究通過單因素危險分析發(fā)現(xiàn)，糖肽類抗生素的使用可能導致MexAB－OprM的表達增高，機制不明。而碳青酶烯類抗生素及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是MexEF－OprN、MexCD－OprJ誘導表達的危險因素，考慮這些抗生素是其合適的底物，過度使用使得耐藥突變株被篩選出來而成為優(yōu)勢菌株。因此，嚴格規(guī)范這些抗生素的使用，可能會減輕Pa MexAB－OprM高表達和 MexEF－OprN、MexCD－OprJ表達，從而減輕細菌耐藥。

多重耐藥Pa外排泵基因表達的危險因素分析，發(fā)現(xiàn)碳青酶烯類和糖肽類抗生素的使用是Pa MexAB－OprM外排泵誘導性高表達的危險因素，碳青酶烯類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用是Pa MexEF－OprN、MexCD－OprJ外排泵誘導性表達的危險因素，提示不合理的抗生素濫用可能是誘導多重耐藥Pa外排泵基因表達的危險因素。在Pa外排泵基因表達的傳播性危險因素分析中，侵入性操作如氣管插管機械通氣、深靜脈置管和留置導尿管等、低WBC、貧血、慢性基礎疾病、入住ICU病房是Pa MexAB－OprM、MexEFOprN、Mex CD－OprJ 3種外排泵傳播性表達或高表達的共同危險因素，可能是因為侵入性操作，破壞了機體的自然免疫屏障，增加了細菌接觸機會，從而增加了耐藥菌株在不同個體之間的傳播。ICU病房環(huán)境中存在多數(shù)耐藥菌株［13］，加之患兒免疫力低下及實施各種侵入性操作，極易導致周圍耐藥菌株的定植并感染。多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，碳青酶烯類抗生素的使用、侵入性操作(包括氣管插管呼吸機輔助通氣和深靜脈置管、留置尿管)、入住ICU病房是Pa 3種常見外排泵表達或高表達共同的獨立危險因素。

總之，多重耐藥銅綠假單胞菌對臨床常用抗生素耐藥嚴重，其耐藥部分是由于Pa多重耐藥外排泵表達或高表達所致。嚴格規(guī)范碳青酶烯類抗生素，大環(huán)內(nèi)酯類及糖肽類抗生素的使用、防止患兒出現(xiàn)各種導致免疫力低下的因素以及嚴格把握入住ICU病房的準入標準，減少不必要的侵入性操作對于防止Pa多藥外排泵系統(tǒng)誘導或傳播性表達的產(chǎn)生具有重要意義。

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