酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽工藝參數(shù)優(yōu)化

李 誠(chéng)，郭奇亮,2，付 剛，陳代文，鄒沫君

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130)

酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽工藝參數(shù)優(yōu)化

李 誠(chéng)1，郭奇亮1,2，付 剛1，陳代文1，鄒沫君1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130)

為獲得具有較高降血壓活性的降血壓肽，選用胰蛋白酶對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行水解。以水解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率為指標(biāo)，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定底物質(zhì)量濃度、水解溫度、pH值、酶用量及水解時(shí)間5個(gè)因素的最適水平范圍，再通過正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量濃度10g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、水解時(shí)間8h、酶用量2000U/g，此時(shí)酶解產(chǎn)物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制率為68.74%。

降血壓肽；豬血紅蛋白；胰蛋白酶；酶解工藝

高血壓病是一種常見的多發(fā)病。據(jù)估計(jì)，目前世界1/4的成年人患有高血壓，這一數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)到2025年會(huì)增加到30%[1]。全球范圍內(nèi)約有760萬(wàn)人由于高血壓病早逝，約占全球病死率13.5%；由高血壓引起的腦卒中和缺血性心臟病分別達(dá)54%和47%[2]。藥物治療高血壓病雖然可以起到一定的作用，但是藥物具有強(qiáng)烈的副作用，嚴(yán)重影響著人們的身心健康。人們迫切希望找到一種可以代替藥物的食源性降血壓產(chǎn)品。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)又稱ACE抑制肽，是一類具有降血壓作用的多肽的總稱。ACEIP的突出優(yōu)點(diǎn)是能有效降低原發(fā)性高血壓患者的血壓，而對(duì)正常人卻沒有降血壓作用，也不會(huì)產(chǎn)生其他副作用。早在1965年，國(guó)外學(xué)者Ferreira[3]首次從巴西蝮蛇蛇毒中分離出具有ACE抑制活性的多肽，1982年，Maruyama等[4]發(fā)現(xiàn)利用胰蛋白酶酶解酪蛋白之后的產(chǎn)物具有體外ACE抑制活性。隨后，越來越多的研究人員分別從不同的食物蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到具有降血壓活性的多肽，報(bào)道的食物有螃蟹、牛肉、蛋黃、玉米等[5-8]。豬血紅蛋白經(jīng)酶解制備的多肽不僅具有易溶解、低黏度、抗凝膠形成等良好的功能特性，而且具有降血壓、降血脂、抗衰老、提高免疫力、緩解心血管疾病以及肥胖癥等重要的生理活性[9]。Mito等[10]等用胃蛋白酶酶解豬血紅蛋白得到了抗高血壓肽；Man Jin等[11]依次用外肽酶Flvourzyme和內(nèi)肽酶Esperase水解豬的血紅蛋白得到富含亞鐵血紅素的低分子質(zhì)量的小肽；有研究表明豬血經(jīng)胰蛋白酶水解得到可增強(qiáng)機(jī)體免疫活性的多肽[12]。酶解制備降血壓肽的研究報(bào)道比較多，但各研究所用酶的種類、酶解參數(shù)(特別是酶的用量)及酶解效果差異比較大。

本研究采用胰蛋白酶對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行水解，對(duì)降血壓肽制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期在較少酶用量情況下獲得具有較高降血壓活性的降壓肽，為利用豬血紅蛋白制備、開發(fā)降血壓肽提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬血 雅安市大興屠宰場(chǎng)。

胰蛋白酶(Trypsin，酶活力1:250) 美國(guó)Amresco公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酸-組氨酸-亮氨酸(HHL) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BR4i型多功能冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；BT-12S電子天平 德國(guó)Sartorius公司；PHS-3C酸度計(jì)方舟科技公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血紅蛋白的制備

本實(shí)驗(yàn)改良Zhao Qiuyu等[13]的方法。在屠宰過程中采集血液(按3g/L加入檸檬酸鈉抗凝)，于低溫條件下(冰塊降溫)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷藏。在4℃條件下將血液9000×g高速冷凍離心10min，得到上層血漿和下層血細(xì)胞。棄去血漿，將血細(xì)胞加入同等體積的生理鹽水沖洗并離心兩次后加入等體積去離子水，在不斷攪拌下超聲波處理20min輔助溶血，之后4℃條件下4000×g冷凍離心10min，得到上清血紅蛋白液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶解條件優(yōu)化

胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽基本過程：按設(shè)定的底物質(zhì)量濃度取豬血紅蛋白液，根據(jù)不同的反應(yīng)條件調(diào)節(jié)溫度、pH值和酶加入量，水解至設(shè)定的時(shí)間，最后沸水浴10min滅酶。在4℃、10000×g離心5min，收集濾液備用。另取豬血紅蛋白用去離子水溶解，作為非酶解對(duì)照液。

1.3.2.1 酶解條件單因素試驗(yàn)

分別考察底物質(zhì)量濃度、水解溫度、pH值、酶用量、水解時(shí)間5個(gè)因素對(duì)豬血紅蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制率和水解度的影響。底物質(zhì)量濃度的影響：設(shè)定豬血紅蛋白質(zhì)量濃度4、6、8、10、12g/100mL，其他條件為溫度45℃、pH8.0、酶用量6000U/g、水解時(shí)間6h。水解溫度的影響：設(shè)定水解溫度35、40、45、50、55℃，其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、pH8.0、酶用量6000U/g、水解時(shí)間6h。pH值的影響：設(shè)定pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、酶用量6000U/g、水解時(shí)間6 h。酶用量的影響：設(shè)定酶用量：2 00 0、4000、6000、8000、10000U/g，其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、水解時(shí)間6h。水解時(shí)間的影響：設(shè)定水解時(shí)間2、4、6、8、10h，其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、酶用量6000U/g。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，按五因素四水平L16(45)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以蛋白質(zhì)水解物ACE抑制率為指標(biāo)，研究最佳酶解條件。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 豬血紅蛋白液的蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法測(cè)定。

1.3.3.2 蛋白酶活力測(cè)定

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》中的福林法測(cè)定，根據(jù)蛋白酶活力確定加酶量。

1.3.3.3 ACE抑制率測(cè)定

參照Cushman等[14]的方法。

1.3.3.4 蛋白質(zhì)水解度測(cè)定

采用甲醛滴定法[15]。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS12.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的ACE抑制率和水解度采用二變量Pearson相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)極差分析各個(gè)酶解參數(shù)水平變化對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率影響的主次順序；用方差分析各個(gè)因素對(duì)胰蛋白酶水解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率影響的顯著性；采用處理間多重比較法(LSD法)分析各個(gè)因素間的相互作用，確定最佳酶解因素水平組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物質(zhì)量濃度的影響

圖1 底物質(zhì)量濃度對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖1可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度和水解產(chǎn)物的ACE抑制率都上升。底物質(zhì)量濃度從4～12g/100mL，質(zhì)量濃度每增加2g/100mL，水解度分別增加2.43%、0.75%、0.79%和0.62%，產(chǎn)物ACE抑制率的增長(zhǎng)分別為4.14%、3.57%、2.88%和1.27%。隨著底物質(zhì)量濃度增加，雖然水解度和產(chǎn)物ACE抑制率都有增加，但是增加的幅度越來越小。底物質(zhì)量濃度從10g/100mL增加到12g/100mL時(shí)，其水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的增加幅度最小，因此確定10g/100mL及以下為最適宜的底物質(zhì)量濃度。

2.2 水解溫度的影響

圖2 水解溫度對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖2可知，水解度與產(chǎn)物ACE抑制率都是先上升后下降，并且都是在溫度為40～45℃間達(dá)到峰值，40～45℃為最適宜溫度。當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度和產(chǎn)物ACE抑制率已經(jīng)大幅下降。因此選擇35、40、45℃和50℃為適宜的水解溫度。

2.3 pH值的影響

圖3 pH值對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖3可知，在pH8.0時(shí)酶解水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率都達(dá)到峰值。而pH6.0時(shí)，水解度和產(chǎn)物ACE抑制率是所有條件下最低的，故選擇pH值為7.0、8.0、9.0和10.0為適宜的酶解條件。

2.4 酶用量的影響

圖4 酶用量對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖4可知，隨著酶用量的增加，胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率都上升。隨著酶用量的繼續(xù)增加，水解度的增加比較平緩，而產(chǎn)物ACE抑制率一直保持著較高增長(zhǎng)率?？紤]酶用量的增加導(dǎo)致成本增加，因此選擇2000、4000、6000U/g和8000U/g為適宜的酶用量。

2.5 水解時(shí)間的影響

圖5 水解時(shí)間對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

由圖5可知，在酶解前期，酶解水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率都快速上升，而從6h開始，水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率增長(zhǎng)速度趨于平緩，8h后增長(zhǎng)幅度不大。因此選擇2、4、6h和8h為適宜的水解時(shí)間。

2.6 酶解條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果與分析分別見表1～3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in orthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

根據(jù)表2極差分析，各因素對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率影響的主次順序依次為C＞A＞D＞B＞E，即pH值＞底物質(zhì)量濃度＞水解時(shí)間＞水解溫度＞酶用量。從表3的方差分析可以看出，底物質(zhì)量濃度、水解溫度、pH值、水解時(shí)間4個(gè)因素對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率的大小均有極顯著的影響，酶用量對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率的大小無顯著影響，區(qū)組間影響差異不顯著。

2.6.2 各試驗(yàn)處理平均數(shù)多重比較(LSD法)

表3結(jié)果顯示，除酶用量對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率無顯著影響外，其他4個(gè)因素都有極顯著影響。因此有必要進(jìn)行各個(gè)試驗(yàn)處理間的多重比較以確定最優(yōu)水平組合。根據(jù)最小顯著差數(shù)法計(jì)算各處理每?jī)山M間的差值和最小顯著差數(shù)LSDα：LSD0.05=2.84，LSD0.01=3.91。

多重比較結(jié)果表明，除幾個(gè)試驗(yàn)組間(包括試驗(yàn)組11號(hào)與4號(hào)，試驗(yàn)組16號(hào)與5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、13號(hào)，試驗(yàn)組13號(hào)與8號(hào)、9號(hào)，試驗(yàn)組8號(hào)與9號(hào)，試驗(yàn)組2號(hào)與10號(hào))差異不顯著外，其余各試驗(yàn)處理組間差異都是顯著或極顯著，說明該正交試驗(yàn)可以篩選確定出最優(yōu)組合。其中，15號(hào)試驗(yàn)處理組與其他處理間差異都為顯著或極顯著。結(jié)合極差分析和方差分析，酶用量是最為次要的影響因素。從降低成本考慮，選擇最小的酶用量，可以確定15號(hào)處理組為最優(yōu)水平組。因此確定胰蛋白酶水解豬血紅蛋白的最佳工藝參數(shù)組合為A4B3C2D4E1，即pH8.0，底物質(zhì)量濃度10g/100mL，水解時(shí)間8h，水解溫度45℃，酶用量2000U/g。

3 結(jié) 論

采用胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽的單因素試驗(yàn)表明胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度與水解產(chǎn)物的ACE抑制率相關(guān)性顯著，ACE抑制率隨著水解度的增減而增減。正交試驗(yàn)表明，酶用量對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響最小，各種酶解參數(shù)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響大小順序?yàn)椋簆H值＞底物質(zhì)量濃度＞水解時(shí)間＞水解溫度＞酶用量；酶用量對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率無顯著影響；胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度10g/100mL，水解溫度45℃，pH8.0，水解時(shí)間8h，酶用量2000U/g，在此條件下水解產(chǎn)物的ACE抑制率為68.74%。

本研究對(duì)采用胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在較少酶用量情況下獲得了具有較高降血壓活性的降壓肽，不僅原料便宜，而且酶用量很少。這為低成本開發(fā)降血壓肽提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]FERNANDEZ-MUSOLES R, LOPEZ-DIEZ J J, TORREGROSA G, et al. Lactoferricin B-derived peptides with inhibitory effects on ECE-dependent vasoconstriction[J]. Peptides, 2010, 31(10): 1926-1933.

[2]陳玲, 鄒栩. 全球心血管藥物研發(fā)動(dòng)態(tài)[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2010, 19 (1): 8-16.

[3]FERREIRA S H, ROCHA e SILVA M. Potentiation of bradykinin and eledoisin by BPF (bradykinin potentiaitng factor) from Bothrops jararaca venom[J]. Experientia, 1965, 21(6): 347-349.

[4]MARUYAMA S, SUZUKI H A. Peptide inhibitor of angiotensin I-converting enzyme in the tryptic hydrolysates of casein[J]. Agric Biol Chem, 1982, 46(5): 1393-1394.

[5]CHEUNG H S, WANG F L, ONDETTI M A, et al. Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence[J]. J Biol Chem, 1980, 255 (2): 401-407.

[6]IROYUKIFUJITA H, EIICHIYOKOYAMA K, YOSHIKAWA M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins[J]. J Food Sci, 2000, 65(4): 564-569.

[7]MIYOSHI S, ISHIKAWA H, KANEKO T, et a1. Structures and activity of angiotensin converting enzyme in soybean hydrolysates[J]. J Agric Biol Chem, 1991, 55(3): 1318-1319.

[8]王海燕, 張佳程. 乳源ACE抑制劑(降血壓肽)的研究現(xiàn)狀[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2001, 27(11): 70-73.

[9]MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2009, 112(1): 211-214.

[10]MITO K, FUJII M, KUWAHARA M, et al. Antihypertensive effect of angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides derived from hemoglobin[J]. European Journal of Pharmacology, 1996, 304(1/3): 93-98.

[11]MAN Jin, HEE J C, NAM-SOON Oh. Process development for hemeenriched peptide by enzymatic hydrolysis of hemoglobin[J]. Bioresource Technology, 2002, 84(1): 63-68.

[12]李艷偉, 江波, 伶祥山. 酶解豬血蛋白中活性肽的純化和功能研究[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2005, 26(1): 61-63.

[13]ZHAO Qiuyu, SANNIER F, PIOT J M. Kinetics of appearance of four hemorphins from bovine hemoglobin peptic hydrolysates by HPLC coupled with photodiode array detection[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1295(1): 73-80.

[14]CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1648.

[15]黃曉鈺, 劉鄰渭. 食品化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2002: 131-132.

Optimization of Process Parameters for Enzymatic Preparation of Antihypertensive Peptides from Porcine Hemoglobin

LI Cheng1，GUO Qi-liang1,2，F(xiàn)U Gang1，CHEN Dai-wen1，ZOU Mo-jun1
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625000, China；2. Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Chengdu 611130, China)

In order to prepare antihypertensive peptide with high activity, trypsin was selected to hydrolyze porcine hemoglobin. The one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize hydrolysis conditions such as substrate concentration, temperature, pH, enzyme dosage and time based on the ACE inhibitory rate of hydrolyzed porcine hemoglobin. The results showed that the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis for 8 h at 45 ℃, pH 8.0, an enzyme dosage of 2000 U/g and a substrate concentration of 10 g/100 mL. Under these hydrolysis conditions, the ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin hydrolysate was 68.74%.

antihypertensive peptide；porcine hemoglobin；trypsin；enzymatic hydrolysis process

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0195-05

2011-08-08

李誠(chéng)(1964—)，男，教授，博士研究生，主要從事動(dòng)物性食品加工與質(zhì)量安全控制研究。E-mail：lichenglcp@163.com