紅三葉異黃酮抗氧化功能及其藥理作用研究進(jìn)展

師旭彤，郭鳳霞，祁 娟

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紅三葉（Trifoloium pratense）又名紅車(chē)軸，是豆科三葉草屬（Trifolium）多年生草本植物。原產(chǎn)于歐洲和西亞，現(xiàn)廣泛分布于世界各地，中國(guó)東北、華北、華南地區(qū)均有栽培。紅三葉含有黃酮類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)和維生素等多種具有價(jià)值的成分，尤其是異黃酮因有植物雌激素樣作用和黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗癌作用而備受關(guān)注。20世紀(jì)40年代以來(lái)，有關(guān)紅三葉異黃酮有效成分及療效的研究日益受到重視，已開(kāi)發(fā)出藥品和保健食品達(dá)百余種。目前，紅三葉異黃酮的提取物是國(guó)際上公認(rèn)的治療婦女更年期綜合癥療效顯著的植物性藥，其銷(xiāo)量在美國(guó)多年來(lái)一直名列前十位［1］。

甘肅省岷縣一帶已形成規(guī)范化種植基地，在地區(qū)特色經(jīng)濟(jì)發(fā)展和土壤輪作倒茬改良中起到積極作用。但人們對(duì)紅三葉的藥用價(jià)值和保健價(jià)值認(rèn)識(shí)尚不全面。本文對(duì)紅三葉異黃酮的抗氧化性及在防治疾病上的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以期對(duì)國(guó)內(nèi)一些科研及醫(yī)藥生產(chǎn)單位更好地開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 紅三葉的形態(tài)特征及生物學(xué)特性

紅三葉為豆科多年生草本植物，高30～80cm，側(cè)根發(fā)達(dá)，莖直立或斜升，葉互生，三出復(fù)葉，小葉橢圓狀卵形至寬橢圓形，葉緣有不明顯的細(xì)齒，小葉無(wú)柄；花序腋生，頭狀，具大型總苞，總苞卵圓形；花萼筒狀，花冠蝶形，淡紅色、紫色或淡紫紅色；莢果小，包被于萼內(nèi)，含種子1粒，橢圓或腎形，棕黃色或紫色，千粒質(zhì)量為1.5g［2－5］。花期8～10月，紅三葉為2倍體植物。

紅三葉適宜在我國(guó)亞熱帶高山低溫多雨地區(qū)種植，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，最適宜生長(zhǎng)在夏天不太炎熱，冬天溫暖，年降水量1 000mm的地區(qū)。生長(zhǎng)最適溫度為15～25℃，能耐－8℃低溫。無(wú)霜期150～220d，生長(zhǎng)良好。喜中性至微酸性土壤，適宜的pH為5.5～7.5。紅三葉原產(chǎn)于歐洲和西亞，現(xiàn)在歐洲各國(guó)及澳大利亞、新西蘭、美國(guó)等國(guó)廣泛栽培［4］。在我國(guó)新疆、云南、貴州、浙江、湖北、江蘇等省均有野生分布［6］。目前，紅三葉有許多適應(yīng)不同環(huán)境的優(yōu)良品種［7］。并且研究發(fā)現(xiàn)各個(gè)時(shí)期異黃酮含量均以葉片中最高，花次之，然后是根，莖、葉柄和托葉［8］。

2 紅三葉異黃酮種類(lèi)

自20世紀(jì)50年代開(kāi)始，人們對(duì)紅三葉植株的化學(xué)成分進(jìn)行了大量的研究，已分離鑒定了異黃酮、黃酮、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)、揮發(fā)油和維生素等多類(lèi)化合物［9］。但最受關(guān)注的是黃酮類(lèi)物質(zhì)，其中，具有“植物雌激素”之稱(chēng)的異黃酮類(lèi)格外受人關(guān)注。異黃酮是一種廣泛存在于植物界的一大類(lèi)化合物，目前，植物中已知的異黃酮有700余種，主要存在于大豆、紅三葉、苜蓿等豆科植物，尤以紅三葉中異黃酮的含量最高［10］。從50年代以來(lái)，Pope、Bate－Smith、Guggolz等科學(xué)家先后從紅三葉植株中分離到許多異黃酮類(lèi)物質(zhì)［11－13］，其中，以鷹嘴豆芽素A（Biochanin A），芒柄花素（Formononetin），染料木素（Genistein），大豆苷元（Daidzein）等4種為主［14］。

3 紅三葉異黃酮的抗氧化作用

3.1 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化作用

紅三葉異黃酮可以抑制膜質(zhì)過(guò)氧化。異黃酮能保護(hù)DNA不被氧化破壞，有效消除紫外線引起的DNA損傷［15］。異黃酮還能抑制小鼠肝組織勻漿液中脂質(zhì)的過(guò)氧化作用，能防止 Vc的氧化［16］。姜義寶等［17］通過(guò)在飼料中添加紅三葉異黃酮，研究其對(duì)肉雞免疫器官、免疫球蛋白及抗氧化性能的影響，發(fā)現(xiàn)紅三葉異黃酮提高了血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，降低了丙二醛（MDA）含量，能夠明顯改善肉雞生產(chǎn)性能、調(diào)節(jié)免疫和提高機(jī)體的抗氧化性。

3.2 清除自由基的傷害

活性氧和自由基是引發(fā)人體衰老、癌變和細(xì)胞損傷的重要原因。紅三葉中含有大量的具有潛在的生物抗氧化和良好的清除自由基功能的異黃酮多酚化合物，且其清除能力與異黃酮的種類(lèi)和含量有一定的關(guān)系。紅三葉提取物中的異黃酮和多酚化合物具有良好的生理健康促進(jìn)作用，被認(rèn)為是有效的抗氧化劑、自由基清除劑和功能食品增補(bǔ)劑［18］。在血紅蛋白與過(guò)氧化氫所致的卵磷脂過(guò)氧化試驗(yàn)中，大多異黃酮均有抑制作用，其中，染料木素和芒柄花素有強(qiáng)抑制作用，其抑制作用與抗氧化劑、維生素E和SOD相當(dāng)［19］。朱宇旌等［7］研究證實(shí)，添加紅三葉黃酮粗提物對(duì)豬油具有良好的抗氧化作用，另外Vc和VE等對(duì)紅三葉黃酮粗提物具有明顯的協(xié)同抗氧化作用。

3.3 提高抗氧化酶的活性

紅三葉異黃酮還可提高抗氧化酶的活性。試驗(yàn)表明，紅三葉異黃酮可顯著提高小腸、皮膚等器官的抗氧化酶數(shù)量，誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化活性升高。楊麗珍等［20］用紅三葉異黃酮高、低劑量及大豆異黃酮、倍美力組對(duì)比治療衰老大鼠實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明紅三葉異黃酮通過(guò)提高SOD活性，降低MDA濃度，達(dá)到提高機(jī)體清除氧自由基能力，從而有效延緩衰老。魏朝良等［21］對(duì)黃酮類(lèi)化合物及清除自由基機(jī)制的探討發(fā)現(xiàn)，紅三葉異黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性與分子結(jié)構(gòu)具有密切關(guān)系，黃酮類(lèi)化合物抗氧化作用是通過(guò)酚羥基與自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定半醌式自由基結(jié)構(gòu)，在一定程度上增加酚羥基，抗氧化活性增加。

大量研究表明，紅三葉異黃酮提取物對(duì)消除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化均有較強(qiáng)作用，能有效延緩油脂脂質(zhì)過(guò)氧化，表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。目前，對(duì)紅三葉異黃酮抗氧化活性的研究，多集中在其幾種單體的研究，而對(duì)紅三葉總黃酮抗氧化及體外清除自由基及其抗氧化效果如何有待進(jìn)一步研究。

4 紅三葉異黃酮的藥理作用

4.1 發(fā)揮雌激素樣作用

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紅三葉研究最多的就是其雌激素樣作用。紅三葉異黃酮為植物雌激素，結(jié)構(gòu)與人體雌激素類(lèi)似，可與雌激素接受器相互作用。專(zhuān)家認(rèn)為，可能是由于異黃酮的雙羥基酚式結(jié)構(gòu)與動(dòng)物體內(nèi)雌激素己烯雌酚和雌二醇結(jié)構(gòu)相似，故能選擇性的與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用。紅三葉異黃酮作為唯一植物雌激素有其獨(dú)到之處，他們具有雙向調(diào)節(jié)作用，當(dāng)人體雌激素水平高時(shí)，可抑制激素分泌，反之，當(dāng)人體雌激素水平低時(shí)，能提供額外的雌激素樣作用。臨床上既用來(lái)治療婦女體內(nèi)雌激素水平升高時(shí)的經(jīng)前期綜合癥，又被用于治療雌激素降低時(shí)的更年期綜合癥和絕經(jīng)［22－26］。另外，也能治療雌激素病，例如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位及骨質(zhì)疏松癥等。紅三葉中發(fā)揮這種雌激素樣功能的化合物主要有鷹嘴豆芽素A、芒柄花素、染料木素和大豆黃素，其中，染料木素活性最強(qiáng)，和雌激素受體的結(jié)合力也最強(qiáng)，大豆苷元次之，芒柄花素活性和與受體的結(jié)合能力最弱，鷹嘴豆芽素A無(wú)結(jié)合力，但有弱雌激素活性，異黃酮甲基化或糖苷化后會(huì)使活性降低［4，5］，紅三葉積累刺芒柄花素的能力最高，并且自真葉的愈傷組織異黃酮含量最高［27，28］。此外，香豆雌酚也具有雌激素樣作用［29］。人體補(bǔ)充紅三葉異黃酮可以預(yù)防和治療激素分泌失調(diào)導(dǎo)致的一系列相關(guān)疾病。Potter等［30］用異黃酮和雌二醇來(lái)抑制或預(yù)防婦女由于內(nèi)源性雌激素減少而引起或加重的疾病如骨質(zhì)疏松、認(rèn)知功能喪失、體重增加、身體脂肪量增加、血管收縮癥狀等。Kelly等［31］用含芒柄花黃素和大豆苷元的藥劑或膳食補(bǔ)充物來(lái)預(yù)防和治療面頰熱、睡眠紊亂等。另?yè)?jù)報(bào)道，異黃酮植物雌激素也被認(rèn)為是一種特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并對(duì)家畜的生產(chǎn)性能可能存在潛在的影響，即能夠替代抗生素和相關(guān)激素等生長(zhǎng)促進(jìn)劑，而成為養(yǎng)殖業(yè)研究的一個(gè)熱點(diǎn)［32］。

4.2 減輕動(dòng)物機(jī)體更年期綜合癥

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)期綜合癥（PMS）有發(fā)病年齡提前、發(fā)病率上升的趨勢(shì)。楊麗珍等［33］研究了紅三葉異黃酮對(duì)更年期大鼠下丘腦β－內(nèi)啡肽的作用，表明紅三葉異黃酮具有改善更年期雌性大鼠下丘腦β－EP神經(jīng)元功能，從而起到穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境和緩解的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，紅三葉異黃酮能顯著改善婦女更年期綜合征。更年后期婦女潮熱的發(fā)病率，在歐洲和北美高達(dá)70%～80%，而在日本、中國(guó)和東南亞國(guó)家，則分別為25%，18%和14%。這種差異是由于這些國(guó)家人們攝入的植物雌激素水平不同所致。有的學(xué)者認(rèn)為紅三葉異黃酮在治療絕經(jīng)期婦女熱潮紅能減少熱潮紅發(fā)生頻率；而有些學(xué)者則認(rèn)為植物雌激素如大豆提取物，紅三葉提取物不能改善熱潮紅或其他絕經(jīng)期癥狀［13］。這一問(wèn)題需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

4.3 提高動(dòng)物機(jī)體免疫能力

異黃酮能提高動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫。秦亮［34］研究紅三葉和紅芪兩種中草藥提取物對(duì)小鼠免疫功能和肉雞生產(chǎn)性能的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，適量的紅芪粗多糖和紅三葉總黃酮提取物能夠增強(qiáng)小鼠非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育。劉寶劍［35］對(duì)紅三葉總黃酮抗氧化作用及其對(duì)免疫功能的影響研究發(fā)現(xiàn)紅三葉總黃酮在適宜濃度范圍內(nèi)具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。

4.4 防止鈣流失及骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡、性別和激素缺乏相關(guān)的疾病。更年后期婦女卵巢雌激素分泌量的急劇減少是引起骨質(zhì)中鈣流失和骨質(zhì)疏松的首要原因。研究發(fā)現(xiàn)植物雌激素異黃酮具有預(yù)防骨吸收和增加骨密度的作用。紅三葉異黃酮對(duì)維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松有一定的預(yù)防作用，其機(jī)制可能與其減緩雌激素水平降低，抑制骨高轉(zhuǎn)換有關(guān)［36］。李穎等［37］對(duì)紅三葉異黃酮對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松防治作用的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉異黃酮對(duì)去卵巢引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥具有明顯的防治作用。有關(guān)異黃酮預(yù)防骨質(zhì)疏松的機(jī)制，現(xiàn)在認(rèn)為，異黃酮作為較弱的雌激素激動(dòng)劑或拮抗劑，與破骨細(xì)胞內(nèi)的受體結(jié)合后抑制其破骨活動(dòng)和骨吸收過(guò)程，加速骨形成過(guò)程。陳琦等［38］研究結(jié)果表明，紅三葉異黃酮通過(guò)提高血清雌激素水平，增加成骨細(xì)胞活性，降低骨高轉(zhuǎn)換率以及減少骨量丟失等多種途徑，能有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。寧鴻珍［39］等研究紅三葉異黃酮對(duì)去卵巢大鼠骨密度及骨代謝的影響，結(jié)果表明紅三葉異黃酮不僅可以維持去卵巢大鼠骨密度，而且可以替代雌激素對(duì)骨代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。

4.5 防治心腦血管性疾病

近年來(lái)對(duì)于紅三葉異黃酮降膽固醇的研究取得了一定的進(jìn)展，國(guó)外一些研究在這方面申請(qǐng)了多項(xiàng)專(zhuān)利。Empie等［40］從紅三葉、苜蓿等植物原料中提取出異黃酮、皂甙等化學(xué)成分，然后把它們按一定比例混合，用混合物治療心臟血管性疾病如血液膽固醇過(guò)高、心臟病、血管功能異常。Atkinson等［41］研究紅三葉異黃酮對(duì)心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的作用，認(rèn)為飲食中補(bǔ)充紅三葉衍生物對(duì)更年期婦女心血管風(fēng)險(xiǎn)因子有一定的保護(hù)作用。Nestel等［42］實(shí)驗(yàn)顯示攝入紅三葉異黃酮，對(duì)改善全身組織動(dòng)脈血管的順應(yīng)性來(lái)減少冠心病冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)因素有顯著的效果。劉紹東等［43］用紅三葉提取液對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血脂的影響進(jìn)行研究，紅三葉提取液能明顯降低高脂血癥大鼠的血脂以及血漿AngⅡ和ET水平，可能對(duì)高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化癥有防治作用。

4.6 防治癌癥

紅三葉提取物能通過(guò)抑制相關(guān)酶類(lèi)等多種途徑而發(fā)揮抗癌作用。研究表明，人體攝入動(dòng)物性激素可誘發(fā)或加劇癌癥的發(fā)生，但若補(bǔ)充植物性激素則可以抑制癌細(xì)胞的繁殖并且可以消滅癌細(xì)胞。Empie等［37］從紅三葉、苜蓿等植物原料中提取出異黃酮、皂苷等化學(xué)成分，制成的混合物治療前列腺癌、皮膚癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、尿道癌等。Roberts D W等［44］研究表明，鷹嘴豆芽素A和（或）芒柄花素可通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗癌作用或間接通過(guò)它們的代謝產(chǎn)物大豆黃素和染料木黃酮抑制CYP1B1而發(fā)揮抗癌作用。Mizunuma等［45］用兩種異黃酮（鷹嘴豆芽素A、大豆黃素），通過(guò)小鼠乳房腫瘤病毒誘導(dǎo)的自發(fā)乳腺癌細(xì)胞模型來(lái)驗(yàn)證異黃酮的抗癌作用，認(rèn)為系統(tǒng)的抗癌效果可能不是通過(guò)大豆黃酮或牛尿酚，而是鷹嘴豆芽素A或染料木黃酮，這兩種物質(zhì)在腸道微生物群的代謝過(guò)程中可能扮演了一個(gè)抑制乳腺癌的角色。Slater等［46］研究，在飼喂紅三葉異黃酮小鼠的前列腺上皮細(xì)胞顯示雌激素β受體和上皮細(xì)胞鈣粘蛋白顯著的增加，表明紅三葉異黃酮對(duì)于前列腺增生能減少潛在的致瘤性轉(zhuǎn)化Renea等［47］研究表明，飲食中添加紅三葉異黃酮可以通過(guò)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡抑制前列腺癌的發(fā)展。尹春萍等［48］研究紅三葉總異黃酮對(duì)人乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖和凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，紅三葉總異黃酮可抑制MCF－7細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，具有抗腫瘤作用。

4.7 預(yù)防肥胖癥

據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示，25%的美國(guó)人和27%的加拿大人的體重超標(biāo)。肥胖尤其上部軀體肥胖會(huì)誘發(fā)高血壓、胰島素排斥等疾病。Ingram等［49］用含異黃酮的合成物治療肥胖癥，避免了其他減肥藥品因含有咖啡因和安非他刺激物加重心臟肌肉和血管的負(fù)擔(dān)，帶來(lái)不利影響。該合成物通過(guò)抑制食欲，攝入少量食物使胃具有飽感來(lái)治療肥胖。

4.8 保護(hù)皮膚免受紫外線傷害

皮膚受到紫外線照射會(huì)引起表皮細(xì)胞DNA和T型淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)的損壞。若長(zhǎng)期暴露于紫外線照射下會(huì)引發(fā)癌癥。異黃酮作為一種遮光劑，具有良好的保護(hù)皮膚、修復(fù)損傷的作用。紅三葉富含牛尿酚異黃酮，它能保護(hù)皮膚免受紫外線的輻射并能抑制皮膚癌的形成［50］。Kelly等［51］用含有芒柄花黃素、雞豆黃素、染料木黃酮、二氫染料木黃酮等載體混合制成的產(chǎn)品來(lái)保護(hù)皮膚免受紫外線照射造成的傷害。

紅三葉異黃酮具有毒性低，藥理作用眾多等優(yōu)點(diǎn)。不但在預(yù)防和治療動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、更年期癥狀、癌癥等方面得到廣泛應(yīng)用，而且在調(diào)節(jié)激素平衡、抗自由基、抗菌、消炎、降血壓等多方面也發(fā)揮著巨大作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉異黃酮還可以防止味精等食品添加劑對(duì)身體健康的破壞。另外，異黃酮類(lèi)化合物在畜牧業(yè)上也有廣闊的應(yīng)用前景，是一種值得推廣的飼料添加劑。隨著對(duì)紅三葉異黃酮生理功能研究的不斷深入，人們也在不斷地?cái)U(kuò)大它的應(yīng)用領(lǐng)域，但尚需要對(duì)它進(jìn)行更加深入的研究，如對(duì)異黃酮類(lèi)化合物長(zhǎng)期過(guò)量使用是否具有毒性等方面。紅三葉的保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品已大量進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，但國(guó)內(nèi)對(duì)這方面的研究還相對(duì)較少。因此，有必要對(duì)該屬植物進(jìn)行更全面、更深入的研究，充分發(fā)掘它們的潛在利用價(jià)值，從而為人類(lèi)帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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