應(yīng)用RNAi技術(shù)防控豬病毒病研究進(jìn)展

呂素芳，郭廣君，王金良，謝金文，董炳梅，沈志強(qiáng)，＊

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指細(xì)胞利用外源性或者內(nèi)源性的雙鏈小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）激發(fā)相關(guān)的酶復(fù)合物對同源性mRNA進(jìn)行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達(dá)，達(dá)到同源基因的減效表達(dá)或不表達(dá)。RNAi可看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制，利用RNAi技術(shù)進(jìn)行病毒感染的干擾試驗已在植物及低等生物中取得滿意的結(jié)果，但在動物體內(nèi)的試驗才剛剛起步。本文對RNAi的原理、豬病方面的研究現(xiàn)狀、存在的問題及發(fā)展趨勢進(jìn)行總結(jié)。

1 RNAi的原理

1.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)

RNAi最早是在1990年由Jorgonson R等人在矮牽?；ǖ难芯恐邪l(fā)現(xiàn)的。1995年康奈爾大學(xué)Guo S博士在線蟲Par－l基因研究中意外地發(fā)現(xiàn)，給線蟲體外注射正義RNA不但不增加該基因的表達(dá)，反而使該基因表達(dá)受到阻斷。隨后Fire A等解釋了此現(xiàn)象，認(rèn)為這種特定基因表達(dá)受抑制的現(xiàn)象是由于污染了微量dsRNA所引起的，正是這些dsRNA引起了基因沉默，并稱此現(xiàn)象為RNA干擾（RNAi）。

1.2 RNAi的分子機(jī)理

RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，dsRNA被Dicer酶切割為21bp～23bp長的小分子干擾RNA片段（small interfering RNA，siRNAs），每個片段的3′端都有2個堿基突出。在動物細(xì)胞中，dsRNA可以通過轉(zhuǎn)染、顯微注射直接導(dǎo)入或者導(dǎo)入能表達(dá)dsRNA的表達(dá)載體［1］。細(xì)胞基因組中反向重復(fù)的DNA序列可轉(zhuǎn)錄生成dSRNA；細(xì)胞感染病毒后，病毒RNA復(fù)制過程中間體也能形成dsRNA。Dicer酶是RNaseH家族的一員，由一個解旋酶結(jié)構(gòu)域、兩個RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域、一個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個PAZ結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。Dicer切割產(chǎn)生siRNA的過程需要dsRNA結(jié)合蛋白 TRBP（trans－activating region－binding protein）和PACT（protected areas conservation trust）等蛋白分子形成蛋白復(fù)合體，并需ATP供能。有一部分siRNA進(jìn)入合成、切割循環(huán)得到進(jìn)一步放大，從而引發(fā)強(qiáng)烈的基因沉默效應(yīng)。

RNAi效應(yīng)階段發(fā)生的關(guān)鍵，是siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA－induced silencing complex，RISC），包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶，RISC具有切割同源的靶mRNA的核酸酶活性，在距離siRNA3′端12個堿基的位置切割mRNA，產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)。

在抗病毒感染領(lǐng)域，RNAi技術(shù)可以防止病毒入侵、抑制病毒復(fù)制、減少病毒RNA數(shù)量、阻斷病毒蛋白的表達(dá)，在各種疾病的基因治療研究中，發(fā)揮出了巨大的潛力和獨特的效果。目前，RNAi技術(shù)已經(jīng)用于許多人的病毒性疾病的研究中，如人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）、流感病毒等［2－5］。RNAi技術(shù)在豬病中的應(yīng)用研究也較多，其中2008年以前的研究進(jìn)展筆者曾總結(jié)過［6］，本文主要對近4年的最新研究進(jìn)行綜述，現(xiàn)分別介紹如下。

2 RNAi技術(shù)抑制病毒的研究

傳統(tǒng)的豬病防控技術(shù)近年來取得巨大進(jìn)展，可是人們?nèi)匀幌Ｍ剿餍碌姆揽胤椒?。RNAi技術(shù)可以防止病毒入侵、抑制病毒復(fù)制、減少病毒RNA數(shù)量、阻斷病毒蛋白的表達(dá)，在抗病毒感染領(lǐng)域，具有較大的潛力。RNA干擾對正鏈RNA病毒更為有效，因為正鏈RNA病毒的基因組是mRNA，可作為病毒復(fù)制的模板。豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）基因組均為單股正鏈RNA，存在大量的siRNA潛在靶位點，是應(yīng)用RNAi防控的理想對象。

2.1 豬瘟病毒

豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的是一種高度傳染性和致死性傳染病，不同品種和年齡豬都易感，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚無有效藥物可以治療該病的感染，RNAi技術(shù)有希望成為根除該病的方法之一。CSFV基因組是單股正鏈RNA，大小約12.3kb，基因組分為5＇UTR、開放閱讀框（ORF）和3＇UTR三部分。其中ORF編碼的多聚蛋白，經(jīng)裂解形成4個結(jié)構(gòu)蛋白（C、E0、E1、E2）和 多 個 非 結(jié) 構(gòu) 蛋 白 （Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。針對CSFV的RNAi研究，近幾年主要集中在 NS3、Npro、NS5B、NS4A、NS2、C等基因。

王鐵東等［7］根據(jù)CSFV石門株Npro基因，構(gòu)建shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)豬胚胎成纖維細(xì)胞，篩選獲得7個穩(wěn)定整合shRNA表達(dá)構(gòu)件的細(xì)胞株。通過間接免疫熒光及子代病毒滴度檢測，結(jié)果有3個細(xì)胞株上CSFV的增殖顯著降低，表明所構(gòu)建的shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒整合細(xì)胞基因組后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的siRNA可以有效抑制病毒復(fù)制。李江南［8］針對CSFV Npro、NS2、NS3基因設(shè)計了6個干擾靶位點，轉(zhuǎn)染PK－15細(xì)胞，通過間接免疫熒光、熒光定量PCR、病毒感染滴度測定等方法進(jìn)行檢測，結(jié)果針對NS3基因的3個靶點能有效抑制CSFV復(fù)制和增殖，抑制率達(dá)85%以上。Xu X R等［9］針對CSFV的Npro和NS5B基因設(shè)計3組siRNAs，轉(zhuǎn)染PK－15細(xì)胞后進(jìn)行病毒感染，72h后進(jìn)行間接免疫熒光檢測，結(jié)果僅少數(shù)實驗組細(xì)胞中能檢測到病毒抗原，而對照組細(xì)胞大多呈陽性。通過實時熒光定量RT－PCR檢測，siRNAs組細(xì)胞中病毒基因組拷貝數(shù)量減少4倍～12倍，病毒的TCID50降低467倍。結(jié)果表明，3個siRNAs能有效抑制病毒基因組復(fù)制和病毒感染，可抑制72h～84h。Li J等［10］針對CSFV的Npro和NS4A基因構(gòu)建3個siRNA載體，轉(zhuǎn)染PK－15細(xì)胞后篩選了穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞克隆。經(jīng)感染病毒72h后檢測，病毒基因組復(fù)制降低186倍。間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)只有很少的細(xì)胞發(fā)生感染，抑制可持續(xù)至120h。表明RNAi技術(shù)可用于CSFV特定基因功能研究及潛在的治療方法。Li J等［11］繼續(xù)針對CSFV的NS3基因設(shè)計3個siRNAs、針對Npro基因設(shè)計2個siRNAs、針對NS5B設(shè)計1個siRNAs，使用相同或4個不同的啟動子分別構(gòu)建單一的、雙重的、四重的siRNA表達(dá)載體。結(jié)果均能有效抑制病毒的復(fù)制，且針對不同基因的siRNAs共同使用時抑制效果最強(qiáng)，為抗CSFV的轉(zhuǎn)基因豬研究提供了基礎(chǔ)。Porntrakulpipat S等［12］根據(jù)CSFV Alfort株的核衣殼蛋白C序列設(shè)計siRNA，轉(zhuǎn)染SK－6細(xì)胞后進(jìn)行病毒感染試驗。結(jié)果0.75μg siRNA即能明顯抑制3.5 log10TCID50／mL劑量的病毒感染。

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV引起的）一種高度傳染性疾病。由于PRRSV嗜巨噬細(xì)胞性、遺傳變異較快、免疫機(jī)制還不十分明確等特征，臨床上常引起免疫應(yīng)答較差、持續(xù)感染性及混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對該病尚無特異有效的治療藥物。PRRSV基因組大小15kb，由8個開放閱讀框（ORF）組 成，即 ORF1a，ORF1b，ORF2－ORF7。ORF1a和ORF1b被認(rèn)為是編碼復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必不可少的酶，ORF2－7編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白，即GP2，GP3，GP4，E，M，N。PRRSV RNAi研究較多的是ORF1b、ORF5、ORF6、ORF1a及 ORF7等。

Li G 等［13－14］構(gòu) 建 了 4 個 攜 帶 S1 株 ORF1b、ORF5、ORF7基因的重組腺病毒介導(dǎo)的shRNAs表達(dá)載體。在Marc－145細(xì)胞內(nèi)能有效降低特異基因的表達(dá)水平、抑制病毒復(fù)制，在豬肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)也可有效抑制病毒復(fù)制，持續(xù)長達(dá)96h。其中針對ORF1b構(gòu)建的載體rAd－P2，在 Marc－145細(xì)胞內(nèi)能抵抗強(qiáng)毒SY0608株的感染。對26周齡豬肌肉注射針對ORF1b的shRNAs表達(dá)載體，24h后進(jìn)行SY0608株攻毒。結(jié)果rAd－P2組豬血清和肺臟中的病毒含量很少，其臨床病理癥狀也比陰性對照組溫和，抑制作用明顯。結(jié)果表明，構(gòu)建的腺病毒介導(dǎo)shRNAs表達(dá)載體可體內(nèi)體外有效抑制PRRSV的感染，為控制該病的感染提供了新的方法。Bao Y等［15］構(gòu)建了20個針對強(qiáng)毒JXwn06株 ORF1b、ORF5、ORF6、ORF 7基因的siRNAs，篩選出了4個最有效。同時構(gòu)建4個靶向ORF1b和ORF6的shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞后用強(qiáng)毒感染。結(jié)果4個載體均能抑制細(xì)胞CPE的產(chǎn)生，與對照細(xì)胞比，病毒滴度降低了1.7倍～600倍，其中針對ORF1b的2個載體抑制效果最強(qiáng)，分別為150、600倍。ORF1和ORF6表達(dá)水平降低，細(xì)胞內(nèi)檢測不到M蛋白。結(jié)果表明，RNAi在細(xì)胞內(nèi)可有效抑制JXwn06強(qiáng)毒株的病毒復(fù)制，為抗PRRSV轉(zhuǎn)基因豬研究奠定基礎(chǔ)。Xiao S等［16］根據(jù)ORF5和ORF6基因序列，構(gòu)建了5個表達(dá)microRNAs的重組質(zhì)粒（amiRNAs），進(jìn)行 MARC－145細(xì)胞內(nèi)試驗，結(jié)果amirGP5－370能顯著抑制病毒增殖，而amir－GP5－370 和 amirM－263 則 效 果 不 明 顯。2 個amirM－263s串聯(lián)的雙重表達(dá)盒與單一的amirM－263相比，對病毒的抑制效果更強(qiáng)。在MARC－145細(xì)胞中，可持續(xù)抑制病毒復(fù)制達(dá)120h。宋德武等［17］根據(jù)JL／07／SW 株 GP5基因，構(gòu)建3個shRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 Marc－145細(xì)胞6h后接種病毒。通過實時熒光定量RT－PCR、間接免疫熒光、TCID50等檢測，結(jié)果構(gòu)建的質(zhì)粒可高效抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。楊閩楠等［18］構(gòu)建了3個靶向N基因的siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞后接毒，結(jié)果可以高效抑制病毒增殖。說明GP5、N基因可能是病毒復(fù)制必需的，為PRRSV基因功能研究、抗病毒研究和轉(zhuǎn)基因動物研究奠定了基礎(chǔ)。Zhou F等［19］構(gòu)建了5個靶向GP5和 M基因的shRNAs，結(jié)果針對ORF6e（261－279nts）的干擾質(zhì)粒具有最高的抑制效率，達(dá)99.09%。同時，建立了重組shRNA質(zhì)粒的Marc－145細(xì)胞系。這些研究揭示RNAi可作為潛在的治療PRRSV的方法，針對GP5和M基因的shRNAs可作為RNA疫苗用于體內(nèi)。

2.3 豬傳染性胃腸炎病毒

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種高度接觸傳染的疾病，對首次感染豬群造成的危害尤為明顯，短期內(nèi)可引起各種年齡的豬發(fā)病，日齡越小，死亡率也愈高。目前對該病的防治以疫苗為主，但是疫苗手段不能徹底控制本病的發(fā)生。TGEV基因組為不分段的單股正鏈RNA，全長約28.5kb，其中5′端近20kb為基因1，編碼病毒的聚合酶（RNA依賴的RNA聚合酶，RdRp），在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)中起著重要的作用。

周俊芳等［20－21］靶向聚合酶序列構(gòu)建2個shRNA表達(dá)載體，ST細(xì)胞增殖試驗表明，2個shRNAs質(zhì)?？捎行б种撇《緩?fù)制，保護(hù)ST細(xì)胞免受病毒破壞，定量RT－PCR結(jié)果顯示干擾質(zhì)?？娠@著減少培養(yǎng)物中病毒RNA的量，體外抑制效率達(dá)95%以上。對25d的SPF小型豬體內(nèi)注射shRNA表達(dá)質(zhì)粒，然后用TGEV感染。通過臨床癥狀、組織病理學(xué)、間接免疫熒光、RT－PCR等檢測，結(jié)果干擾組豬不同器官內(nèi)的病毒含量均顯著減少，能保護(hù)小型豬抵抗病毒的感染。表明特異的shRNAs可作為一種新的抗TGEV藥物用于將來的研究。

2.4 豬圓環(huán)病毒2型

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV－2）屬于圓環(huán)病毒科，具致病性，與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征有關(guān)。PCV－2能造成免疫抑制，繼而易發(fā)其他感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，急需尋找新的有效的防治方法。PCV－2基因組為單股、負(fù)鏈、環(huán)狀DNA，長1 767bp或1 768bp，11個ORF幾乎都有部分重疊，其中ORF1編碼復(fù)制酶（Rep），ORF2編碼衣殼蛋白（Cap），前者與病毒基因復(fù)制有關(guān)，后者具有良好的免疫原性，是機(jī)體抵抗PCV－2感染的主要免疫原。

Wang H等［22］根據(jù)rep基因設(shè)計2個siRNAs、根據(jù)cap基因設(shè)計1個siRNA，插入含U6啟動子的pSIREN－RetroQ ZsGreen載體，篩選獲得5個陽性克隆。進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)試驗，通過實時定量PCR和免疫組化檢測，結(jié)果表明構(gòu)建的干擾質(zhì)?？娠@著抑制病毒的復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)抑制效率達(dá)99%，小鼠體內(nèi)抑制效率為26%～99%。李曼等分別針對rep、cap蛋白基因構(gòu)建特異的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染PK－15細(xì)胞后20h感染PCV－2。結(jié)果siRNA在細(xì)胞中對PCV－2增殖具有很強(qiáng)的抑制作用，病毒滴度顯著降低。針對不同位點的siRNA抑制效果不同，抑制時間可持續(xù)至感染后60h［23］。說明RNAi可以為抗PCV－2感染提供一種有效的治療策略。

3 存在問題與發(fā)展趨勢

RNAi被發(fā)現(xiàn)以來廣泛應(yīng)用于抗病毒領(lǐng)域，從癌癥、傳染性疾病、遺傳性疾病，到呼吸系統(tǒng)疾病等［24－25］。體內(nèi)外研究顯示，只需很低的劑量就能達(dá)到顯著、特異的效果，有望成為抗病毒治療的有效方法。近年來，一些基于RNAi的抗病毒藥物已進(jìn)入臨床試驗階段，這些病毒包括 HIV－1、HCV、HBV等，均取得很大進(jìn)展。但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi的治療并不如人們一開始預(yù)想的那樣順利，病毒在不斷進(jìn)化以逃逸RNAi，人們要想在抗病毒治療的臨床方面取得成功，不得不重新考慮這些問題［25］。病毒可通過多種途徑逃逸RNAi：①病毒靶位點區(qū)域突變。因為利用RNAi的治療周期比較長，這也是篩選具有抵抗力的突變株的過程。突變通常在靶位區(qū)的1個堿基的置換或缺失，靶位點上游的突變也能導(dǎo)致逃逸。應(yīng)盡量避免單個siRNA長時間治療，可多個siRNAs同時使用，防止突變體的產(chǎn)生。②病毒RNA結(jié)構(gòu)改變，使其基因組難以與RISC結(jié)合來抵抗RNAi作用。③病毒編碼抑制因子或病毒蛋白修飾，這些蛋白可干擾RNAi機(jī)制中的特定步驟。不過由于RNAi具有顯著特異的抑制作用，這種影響不是很嚴(yán)重。另外，利用RNAi的治療效果無法預(yù)計，研究表明不是所有的siRNA都能產(chǎn)生同樣的干涉效應(yīng)，引起這種差異的原因目前仍不清?？傊琑NAi技術(shù)應(yīng)用與抗病毒病的治療還面臨著嚴(yán)峻的考驗。只有解決這一系列的基礎(chǔ)問題，才能使RNAi技術(shù)作為抗病毒的手段更多的用于臨床，有望成為各種病毒性疾病預(yù)防和治療的一個有效途徑。

［1］Higuchi Y，Kawakami S，Hashida M.Strategies forinvivodelivery of siRNAs：recent progress［J］.Bio Drugs，2010，24（3）：195－205.

［2］Zeller S J，Kumar P.RNA－based gene therapy for the treatment and prevention of HIV：from bench to bedside［J］.Yale J Biol Med，2011，84（3）：301－309.

［3］Weinberg M S，Arbuthont P.Progress in the use of RNA interference as a therapy for chronic hepatitis B virus infection［J］.Genome Med，2010，2（4）：28.

［4］Ashfaq U A，Yousaf M Z，Aslam M，et al.siRNAs：potential therapeutic agents against hepatitis C virus［J］.Virol J，2011，8：276.

［5］Stertz S，Shaw M L.Uncovering the global host cell requirements for influenza virus replication via RNAi screening［J］.Microbes Infect，2011，13（5）：516－525.

［6］呂素芳，郭廣君，魏 鳳，等.RNAi抑制豬主要病毒感染的研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（1）：88－91.

［7］王鐵東，逄大欣，歐陽紅生.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體RNAi技術(shù)抑制豬瘟病毒在豬胚胎成纖維細(xì)胞的增殖［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（3）：14－17.

［8］李江南.RNA干擾途徑抗豬瘟病毒研究［D］.吉林長春：吉林大學(xué)，2011.

［9］Xu X R，Guo H C，Xiao C，et al.Invitroinhibition of classical swine fever virus replication by siRNAs targeting Npro and NS5Bgenes［J］.Antiviral Res，2008，78（3）：188－193.

［10］Li J，Guo H，Shi Z，et al.Invitroinhibition of CSFV replication by retroviral vector－mediated RNA interference［J］.J Virol Methods，2010，169（2）：316－321.

［11］Li J，Dai Y，Liu S，et al.Invitroinhibition of CSFV replication by multiple siRNA expression［J］.Antiviral Res，2011，91（2）：209－216.

［12］Porntrakulpipat S，Supankong S，Chatchawanchonteera A，et al.RNA interference targeting nucleocapsid protein （C）inhibits lassical swine fever virus replication in SK－6cells［J］.Vet Microbiol，2010，142（1－2）：41－44.

［13］Li G，Jiang P，Li Y，et al.Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication by adenovirus－mediated RNA interference both in porcine alveolar macrophages and swine［J］.Antiviral Res，2009，82（3）：157－165.

［14］Li G，Jiang P，Li Y，et al.Effective suppression of replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by adenovirus－mediated small interfering RNAs targeting ORF1b，5 and 7genes［J］.J Virol Methods，2009，157（1）：40－46.

［15］Bao Y，Guo Y，Zhang L，et al.Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication by RNA interference in MARC－145cells［J］.Mol Biol Rep，2012，39（3）：2515－2522.

［16］Xiao S，Wang Q，Gao J，et al.Inhibition of highly pathogenic PRRSV replication in MARC－145cells by artificial microRNAs［J］.Virol J，2011，1（8）：491.

［17］宋德武，李志杰，王曉莉，等.RNAi靶向GP5基因抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在 MARC－145細(xì)胞中的復(fù)制［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（8）：1013－1017.

［18］楊閩楠，李志杰，丁 壯，等.RNAi靶向N基因抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的復(fù)制［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（12）：1571－1576.

［19］Zhou F，Liang S，Chen A H，et al.A transgenic Marc－145cell line of piggyBac transposon－derived targeting shRNA interference against porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Vet Res Commun，2012，36（2）：99－105.

［20］周俊芳，華修國，崔 立，等.shRNA表達(dá)質(zhì)粒體外防治豬傳染性胃腸炎病毒感染［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2009，27（1）：24－27.

［21］Zhou J F，Huang F，Hua X G，et al.Inhibition of porcine transmissible gastroenteritis virus （TGEV）replication in mini－pigs by shRNA［J］.Virus Res，2010，149（1）：51－55.

［22］Wang H，Liu W，Gao S，et al.Inhibition of porcine circovirus type 2replication by the plasmid vector expressing siRNAs［J］.Wei Sheng Wu Xue Bao，2008，48（11）：1507－1513.

［23］李 曼，宋勤葉，李艷琴，等.基于質(zhì)粒表達(dá)的siRNA對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）復(fù)制的抑制作用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（3）：513－520.

［24］Devincenzo J P.The promise，pitfalls and progress of RNA－interference－based antiviral therapy for respiratory viruses［J］.Antivir Ther，2012，17（1PtB）：213－225.

［25］He M，Wang Z W.Current status and development of miRNA and siRNA research on gastric cancer［J］.Yi Chuan，2011，33（9）：925－930.