丁酸梭菌對蛋用仔公雞生長性能、免疫指標及空腸組織相關細胞因子基因mRNA表達的影響

劉亭婷 滑 靜 王曉霞 劉莉如 海 鵬

隨著抗生素作為飼料添加劑的廣泛應用，它的弊端也逐漸被人們所認識，如導致動物胃腸道正常菌群失調，產生耐藥性和藥物殘留等副作用，給畜禽和人類的健康都帶來了危害，有些國家已從立法上限制了抗生素的使用。因此，尋求綠色、無公害并能夠提高畜禽營養(yǎng)素利用率和免疫功能的添加劑越來越受到人們的關注。研究發(fā)現，微生態(tài)制劑能夠提高飼料報酬、促進動物生長、降低幼畜禽死亡率、防治消化道疾病等［1］。丁酸梭菌是普遍存在于人和動物腸道內的一種益生菌，丁酸梭菌代謝可以產生丁酸，從而抑制腸道有害菌生長和繁殖，同時刺激黏膜免疫；還可以產生B族維生素、維生素K、葉酸和多種酶類物質等，對機體有重要的生理功能。目前，對該菌的研究主要集中在人的腹瀉、炎癥性腸病的防治與預防上，然而，在動物，尤其在蛋用仔公雞生產上應用的研究鮮有報道。本試驗旨在通過在蛋用仔公雞基礎飼糧中添加丁酸梭菌，測定蛋用仔公雞的生長性能、免疫器官指數和血清免疫指標等，來探討該菌對生長和免疫的影響，并從分子水平探討丁酸梭菌對機體細胞因子的影響機理，為其在家禽生產中的應用提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌由浙江惠嘉生物科技有限公司提供，其中活菌數≥1.0×108CFU／g。

1.2 試驗設計與飼糧組成

試驗采用單因子完全隨機區(qū)組設計，選用1日齡健康的海蘭褐蛋用仔公雞240只，平均體重為（39.36±0.11）g，隨機分為6組，每組4個重復，每個重復10只雞。對照組飼喂基礎飼糧，抗生素組飼喂在基礎飼糧中添加150 mg／kg金霉素的飼糧，試驗組飼喂分別在基礎飼糧中添加250、500、750、1 000 mg／kg丁酸梭菌的飼糧?；A飼糧是根據美國NRC（1994）推薦的肉仔雞營養(yǎng)需要配制的玉米－豆粕型飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用3層籠養(yǎng)，自由采食和飲水，光照、溫度和濕度嚴格按照常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進行，按照常規(guī)免疫程序進行免疫，并定期清掃雞舍和消毒保持雞舍清潔衛(wèi)生。試驗期為42 d。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 生長性能指標

試驗雞空腹12 h，以重復為單位分別在試驗的第14、28和42天稱重結料，并記錄死亡雞只數，及時結料用于計算平均體重（average body weight，ABW）、平均日采食量（average daily feed intake，ADFI）、平 均 日 增 重 （average daily gain，ADG）和料重比（f eed／gain ratio，F／G）。

1.4.2 免疫器官指數

于試驗的第42天對試驗雞無菌采樣，每個重復隨機取1只雞稱重后屠宰，屠宰時采血，制備血清，樣品于－20℃保存待測。摘取胸腺、脾臟和法氏囊，剔除脂肪后稱鮮重。用所得的免疫器官重與體重的比計算免疫器官指數［公式：免疫器官指數（g／kg）＝免疫器官重（g）／體重（kg）］。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 1 Co mposition and nutrient levels of the basal diet（air－dry basis） %

1.4.3 血清免疫指標

血清中的免疫球蛋白G（Ig G）、免疫球蛋白A（Ig A）和免疫球蛋白M（Ig M）含量采用免疫透射比濁法進行測定，補體3（C3）、補體4（C4）含量采用ELISA試劑盒檢測，溶菌酶活性測定采用比色法，所用試劑盒均購于北京康源瑞得生物技術有限公司。

1.4.4 空腸組織中相關細胞因子的基因mRNA相對表達水平

1.4.4.1 引物設計與合成

根據Gen Bank公布的雞基因序列設計引物如表2，引物由北京優(yōu)博奧生物技術有限公司合成。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Pri mer sequences f or fluorescence－based quantitative real－ti me PCR

1.4.4.2 組織樣本總RNA的提取和反轉錄

用超純 RNA提取試劑盒（CWbio.Co.，Ltd.，Cat＃CW0581）提取組織樣本中總 RNA。操作按照產品說明書進行。對所提取的RNA進行檢測，判斷有無污染。c DNA合成按Hi Fi－MMLV c DNA第1鏈合成試劑盒（CWbio.Co.，Ltd.，Cat＃CW0744）說明書操作。

1.4.4.3 實時熒光定量PCR擴增條件

采用20μL反應體系：Real SYBR Mixture（2×）10μL，10μmol／L上、下游引物各0.4μL，c DNA 2μL，加入去離子水至20μL。反應條件：95℃10 min，（95℃15 s，60℃60 s）×40個循環(huán)。

1.4.4.4 標準曲線繪制

本試驗以逆轉錄的c DNA作為待測基因的標準品，制作各自的標準曲線。具體方法如下：取逆轉錄的c DNA樣本，進行5倍梯度稀釋，每個稀釋度設3組重復，進行實時熒光定量檢測，采用2－△△Ct法分析待測空腸組織中相關細胞因子白細胞介素－6（IL－6）、干擾素－γ（IFN－γ）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的基因mRNA相對表達水平。

1.5 數據統(tǒng)計和處理

所有試驗數據均用Excel進行初步處理，應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，用one－way ANOVA比較各組間相關指標的差異，采用最小顯著級差法對差異顯著的數據進行多重比較。試驗數據均以平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞生長性能的影響

由表3可知，蛋用仔公雞在1 4日齡時500 mg／kg 添 加 組、750 mg／kg 添 加 組、1 000 mg／kg添加組的平均體重顯著高于對照組（P＜0.05），750 mg／kg添加組為最大值，但與其他試驗組間差異不顯著（P＞0.05），各試驗組與抗生素組相比也差異不顯著（P＞0.05）。28日齡時，1 000 mg／kg添加組的平均體重顯著高于對照組和抗生素組（P＜0.05），42日齡時，顯著高于對照組（P＜0.05）。

試驗期間，平均日增重最高的是1 000 mg／kg添加組，比對照組高出10.26%（P＜0.05），其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。

各組的平均日采食量、料重比均差異不顯著（P＞0.05），但各試驗組平均日采食量隨著飼糧中丁酸梭菌添加量的增加有增加的趨勢，料重比則有下降的趨勢。

2.2 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞免疫器官指數的影響

所有屠宰的蛋用仔公雞免疫器官外觀均未見異常。由表4可知，42日齡時，各試驗組胸腺指數均在一定程度上高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05），各試驗組之間也差異不顯著（P＞0.05），但胸腺指數隨著飼糧中丁酸梭菌添加量的增加而呈現出遞增趨勢。

1 000 mg／kg添加組的脾臟指數最高，比對照組提高了24.87%（P＜0.05），比抗生素組提高了10.55%（P＞0.05），其他各試驗組也比對照組略有升高，但與對照組和抗生素組均差異不顯著（P＞0.05）。

各組之間的法氏囊指數均差異不顯著（P＞0.05）。

表3 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞生長性能的影響Table 3 Effects of dietar y Clostridiu m butyricu m level on gr owth perf or mance of egg－laying male chicks

表4 飼糧中丁酸梭菌水平對42日齡蛋用仔公雞胸腺、脾臟、法氏囊指數的影響Table 4 Effects of dietary Clostridiu m butyricu m level on the indices of thy mus，spleen and bursa of Fabricius of egg－laying male chicks aged 42 days

2.3 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞血清免疫指標的影響

由表5可知，隨著飼糧中丁酸梭菌添加量的增加，檢測的蛋用仔公雞各項血清免疫指標均有增加的趨勢。1 000 mg／kg添加組對試驗期各免疫指標的影響最大。

42日齡時，各添加組血清Ig G的含量與對照組相比均顯著提高（P＜0.05），750 mg／kg添加組、1 000 mg／kg添加組血清Ig G的含量與抗生素組相比均有提高，差異顯著（P＜0.05），試驗組中血清Ig G含量最高的是1 000 mg／kg添加組，與250 mg／kg添加組、500 mg／kg添加組相比差異顯著（P＜0.05）。

1 000 mg／kg添加組血清Ig A的含量最高，顯著高 于 對 照 組 和 抗 生 素 組 （P＜0.05），與250 mg／kg添加組、500 mg／kg添加組相比也均差異顯著（P＜0.05），但與750 mg／kg添加組相比差異不顯著（P＞0.05）。

各試驗組血清Ig M含量與對照組和抗生素組相比差異不顯著（P＞0.05）。

血清C3含量的檢測結果顯示，各試驗組血清C3含量與對照組相比顯著提高（P＜0.05），除250 mg／kg添加組外，其余各試驗組血清C3含量與抗生素組相比也顯著提高（P＜0.05），其中1 000 mg／kg添加組血清C3含量最高，比對照組提高62.82%，比抗生素組提高51.18%，各試驗組之間差異不顯著（P＞0.05）。

血清C4的含量隨著丁酸梭菌添加量的增加有增加趨勢，但組間差異不顯著（P＞0.05），與對照組相比也均差異不顯著（P＞0.05）。

各試驗組血清溶菌酶活性與對照組相比均略有提高，但差異不顯著（P＞0.05）。

表5 飼糧中丁酸梭菌水平對42日齡蛋用仔公雞血清Ig G、IgA、Ig M、C3、C4含量和溶菌酶活性的影響Table 5 Effects of dietary Clostridiu m butyricu m level on the contents of Ig G，Ig A，Ig M，C3 and C4 and the activity of lysozy me in ser u m of egg－laying male chicks aged 42 days

2.4 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞空腸組織中IL－6、IFN－γ 及 TNF－α mRNA 相 對 表 達水平的影響

由表6可知，關于42日齡時蛋用仔公雞空腸組織中IL－6 mRNA相對表達水平，750 mg／kg添加組、1 000 mg／kg添加組與對照組相比顯著降低（P＜0.05），與 抗 生 素 組 均 差 異 不 顯 著 （P＞0.05），250 mg／kg添加組、500 mg／kg添加組與對照組和抗生素組均差異不顯著（P＞0.05），各試驗組之間差異也不顯著（P＞0.05）。

關于IFN－γmRNA相對表達水平，各試驗組與對照組和抗生素組相比均差異不顯著（P＞0.05），各試驗組之間也差異不顯著（P＞0.05），但隨著飼糧中丁酸梭菌添加量的增加，蛋用仔公雞空腸組織中IFN－γmRNA相對表達水平呈現下降的趨勢。

關于TNF－αmRNA相對表達水平，1 000 mg／kg添加組最低，與對照組相比差異顯著（P＜0.05），比對照組降低了45.91%，與抗生素組差異不顯著（P＞0.05），其余各試驗組與對照組和抗生素組均差異不顯著（P＞0.05），各試驗組之間也差異不顯著（P＞0.05）。

表6 飼糧中丁酸梭菌水平對42日齡蛋用仔公雞空腸組織中IL－6、IFN－γ及TNF－αmRNA相對表達水平的影響Table 6 Eff ects of dietary Clostridiu m butyricu m level on IL－6，IFN－γand TNF－α mRNA relative expression levels in jejunu m tissue of egg－laying male chicks aged 42 days

3 討 論

3.1 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞生長性能的影響

畜禽平均日增重和料重比是反映丁酸梭菌飼喂效果的重要指標。丁酸梭菌的促生長作用已經被很多試驗證實。杜云平等［2］研究表明，基礎飼糧中添加0.3%的丁酸梭菌制劑能夠改善肉雞的生產性能，有提高日增重、降低料重比的趨勢，還有效預防了腸炎的發(fā)生，提高了肉雞的抗病力和免疫力。楊欣［3］在不同油脂類型飼糧中添加丁酸梭菌飼喂肉仔雞，顯著降低了肉仔雞盲腸食糜p H，顯著增加了盲腸乳酸桿菌數，同時還顯著增加了盲腸中丁酸、乙酸、戊酸及總短鏈脂肪酸含量和空腸黏膜堿性磷酸酶活性，這表明丁酸梭菌可以提高腸道食糜中主要代謝產物丁酸的含量，降低p H，進而抑制大腸桿菌等有害菌生長，促進乳酸菌等有益菌的繁殖，并進一步增加其他短鏈脂肪酸的含量，從而改善腸道環(huán)境，起到促生長的作用。Araki等［4－6］報道，丁酸梭菌在腸道內能產生丁酸、B族維生素、維生素K、葉酸等物質，對機體具有保健作用，還能產生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等，這些酶系有重要的生理功能，這可能也是丁酸梭菌改善動物生長性能的機理之一。本試驗結果表明，丁酸梭菌添加水平為1 000 mg／kg時，平均日增重最高，料重比最小，說明適宜的丁酸梭菌添加水平對蛋用仔公雞的生長性能有一定的促進作用。但蛋用仔公雞42日齡時體重總體上偏低，推測可能在試驗后期飼養(yǎng)環(huán)境溫度較高，超過了生長適宜溫度范圍，仔公雞采食量下降，導致42日齡時平均體重偏低。

3.2 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞免疫器官指數的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是禽類的重要免疫器官。胸腺和法氏囊是雞的中樞免疫器官，胸腺參與機體非特異性免疫，對細胞免疫以及體液免疫都有重要的調節(jié)作用。法氏囊是禽類特有的，是B細胞分化成熟的場所。脾臟是禽類最大的外周免疫器官，是機體細胞免疫和體液免疫的中心，是產生致敏淋巴細胞和抗體的重要場所。上述3個器官的發(fā)育狀態(tài)和機能強弱直接影響家禽全身的免疫水平。一般認為免疫器官質量增加是由于其自身細胞生長發(fā)育和分裂增殖所致，是免疫增強的表現，免疫指數的提高表明該器官成熟快。本試驗的結果表明，42日齡時，蛋用仔公雞的胸腺指數和法氏囊指數與對照組均差異不顯著，但隨著飼糧中丁酸梭菌添加量的增加均有升高的趨勢，1 000 mg／kg丁酸梭菌添加組的脾臟指數，雖與抗生素組相比差異不顯著，但顯著高于對照組，這表明丁酸梭菌對蛋用仔公雞生長發(fā)育前期的免疫器官發(fā)育有積極作用，能夠促進仔公雞免疫系統(tǒng)發(fā)育，增強機體對外界刺激的抵抗能力，達到健康生長的目的。

3.3 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞血清免疫指標的影響

免疫是機體識別和排除抗原性異物、保持體內外平衡的生理反應。動物機體的免疫功能主要是通過免疫分子（免疫球蛋白、細胞因子和補體）來發(fā)揮作用，提高抗體免疫應答能力。免疫球蛋白（Ig G、Ig A、Ig M等）是主要的免疫分子。Ig G是單體免疫球蛋白，其血清含量遠高于其他免疫球蛋白，且維持時間長，是機體抗感染的主要力量。Ig M產生時間最早，其調理、殺菌和凝集作用均強于Ig G，但半衰期短，作用范圍窄，在感染早期起先鋒免疫作用。Ig A是外分泌液中的主要免疫球蛋白，在保護腸道、呼吸道等抵抗微生物入侵方面起關鍵作用，能凝集顆粒性抗原和中和病毒。C3、C4是補體系統(tǒng)中含量最多、最重要的組成部分，對免疫功能起著重要的作用，它們在機體防御過程中可以通過調理吞噬、裂解細胞、清除免疫復合物等機理對病原微生物進行清除及活化炎性細胞對靶細胞的殺傷作用。溶菌酶主要由巨噬細胞分泌，是非特異性免疫的效應物，通過降解細菌多糖細胞壁殺滅細菌，保護機體免受感染［7］。

張彩云等［8］選用160頭21日齡杜×長×大斷奶仔豬作研究，結果表明，與對照組相比，飼糧中添加丁酸梭菌組血清中Ig G和C3含量顯著提高，還具有提高血清Ig A含量的趨勢。宋增福［9］的研究表明了丁酸梭菌對鮸魚消化酶、體液免疫等方面的影響，該菌可以提高鮸魚腸道消化酶、血清和體表黏液溶菌酶等的活性，增加血漿中的Ig M含量。上述報道與本研究相一致，本試驗的結果表明，丁酸梭菌可以提高血清中Ig G、Ig A、C3的含量，1 000 mg／kg添加組顯著高于對照組和抗生素組，說明一定劑量的丁酸梭菌可提高機體的體液免疫水平，改善蛋用仔公雞免疫功能，增強疾病抵抗力。

3.4 飼糧中丁酸梭菌水平對蛋用仔公雞空腸組織中IL－6、IFN－γ 及 TNF－α mRNA 相 對 表 達水平的影響

細胞因子包括淋巴因子、干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子、趨勢化因子等，主要是由免疫細胞分泌的能調節(jié)細胞功能的參與炎癥反應、免疫反應、創(chuàng)傷愈合等過程的蛋白質和小分子多肽組成［10］。IL－6、TNF－α是黏膜免疫中介導炎癥的細胞因子，在急慢性炎癥反應中起重要作用，IFN－γ是獲得性免疫的細胞因子，可介導獲得性免疫的3個時相，使機體獲得性免疫得到加強［11］。IL－6等前炎癥細胞因子可促進免疫細胞增殖和分化，從而提高動物機體的抵抗力。有試驗證明，丁酸梭菌對于葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的急性潰瘍性結腸炎（UC）小鼠有治療作用，可以抑制TNF－α的基因表達［12］。其實，在正常情況下，這些細胞因子的過度分泌會對機體產生負面影響，即導致營養(yǎng)物質的重新分配，將用于維持生長和骨骼肌沉積的營養(yǎng)物質轉向于維持免疫反應，從而降低營養(yǎng)物質的利用效率，最終影響機體生長［13］。這說明正常的生理情況下，沒有病毒或其他誘生劑的作用，機體的免疫功能處于平穩(wěn)狀態(tài)，細胞因子的分泌受到一定程度的抑制，對于機體是有利的。本試驗的結果表明，1 000 mg／kg丁酸梭菌添加組與對照組相比顯著降低了IL－6和TNF－αmRNA相對表達水平，IFN－γmRNA相對表達水平與對照組差異不顯著，但隨著丁酸梭菌添加量的增加也呈現下降的趨勢。分析其作用機理可能與丁酸的作用密不可分，丁酸梭菌的主要代謝產物是丁酸，丁酸能夠促進動物腸道的上皮細胞繁殖，尤其對于炎癥性腸疾病，具有腸道黏膜修復和逆轉黏膜通透性增加的功能，并且丁酸能夠刺激腸道黏膜免疫活性，影響參與免疫調節(jié)的某些細胞因子等［14－16］。另外一個原因可能是與其對腸道微生物群平衡的調整有關，益生菌的增加，導致致病菌和潛在致病菌無法或較少與腸黏膜接觸，其啟動下游事件的能力被降低，結果表現為各種促炎細胞因子、組織因子表達的下調，從而免疫功能增強，抑制炎癥［17］。也有一些試驗結果與本試驗不一致，可能是由于各試驗所使用的菌株、試驗地點、試驗時間（季節(jié)）、飼養(yǎng)條件、動物生理狀態(tài)的不同而導致的。

4 結 論

① 本試驗條件下，飼糧中添加適量丁酸梭菌可以促進蛋用仔公雞的生長，提高平均體重和日增重，降低料重比。

② 飼糧中添加適量丁酸梭菌可以提高免疫器官指數，促進免疫器官發(fā)育；能夠增加血清中Ig G、Ig A等免疫指標的含量，增強免疫功能。

③ 飼糧中添加適量丁酸梭菌可以降低空腸組織中IL－6、IFN－γ 及 TNF－α mRNA 相 對 表 達 水平，從而增強機體的免疫力，減輕腸道炎癥的發(fā)生。

④ 本試驗條件下，1 000 mg／kg的添加量效果最好。

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