鈣結合蛋白S100A6與腫瘤和細胞信號轉導的相關研究進展

李 暉，關宏偉

(1.鄭州大學 西亞斯國際學院 護理學院，河南 新鄭 451150；2.大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 病理科，遼寧 大連116011)

S100蛋白家族是一類非泛素化、EF-手型鈣結合蛋白，通過與鈣離子及靶蛋白的相互作用，在體內發(fā)揮多種生物學作用，參與細胞周期活動、細胞分化、腫瘤生長以及細胞外基質分泌活動等過程，其分布具有細胞、組織特異性。其多個成員在腫瘤中表達異常，并與腫瘤的增殖、浸潤轉移和凋亡密切相關[1]，其中包括S100A6。S100A6又稱為鈣周期蛋白(Calcyclin，Cacy)，過去也稱為2A9、5BlO、PRA和CACY。

1 S100A6蛋白概述

1.1 S100A6的發(fā)現及基因的染色體定位

S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中檢出，它在細胞內廣泛分布，主要存在于胞質、胞膜以及核被膜上，包括核膜的內表面；其分布受細胞分裂狀態(tài)和鈣離子濃度的影響，當改變細胞內鈣離子濃度時，S100A6的分布也會發(fā)生改變，與細胞進入S期有關[2]。

S100A6基因位于人染色體的lq21的250～350 kb之間，并與S100A1～5、S100A7～10，S100C等S100基因家族成員和表皮分化基因共同位于1750 kb區(qū)域之間[3]。S100A6基因與原癌基因ski毗鄰。

1.2 S100A6基因結構及基因表達機制

1.2.1 S100A6的基因結構

S100A6(GenBank accession number，M18981)是單拷貝基因，又稱為催乳素受體相關蛋白(prolactin receptor-associated protein，PRA)，包含3個外顯子，被2個內含子所分隔。全長共470個核苷酸，起始密碼TGA位于103 bp處，終止密碼位于373 bp處。因此開放閱讀框為270個核苷酸，共編碼90個氨基酸。

1.2.2 S100A6的基因表達機制

為了研究S100A6在細胞中特異性表達的分子機制，首先對其基因啟動子做了相關研究。研究發(fā)現，兩個E-box元件在S100A6啟動子的轉錄調控中發(fā)揮作用。其序列分別位于S100A6基因啟動子的-283/-278和-593/-588位置。運用電泳遷移率變動分析法(EMSA,electrophoretic mobility shift assay)和染色質免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation)檢測顯示，轉錄因子中的上游刺激因子1(USF1)與兩個E-box調節(jié)元件結合增強了S100A6啟動子的轉錄活性[4-5]。同時發(fā)現，引起氧化應激的因子例如鎘離子使S100A6基因活化，但引起氧化應激的因子一旦與位于S100A6基因啟動子-290/-281的突變的抗氧化應答元件(ARE,antioxidant response element)結合，由于該元件覆蓋了可被USF識別的E-box序列，可導致S100A6基因啟動子活性被抑制[6]。由此推測，S100A6的表達可能對通過轉錄因子識別啟動子調控位點作用的信號途徑做出了應答。

目前，通過對外遺傳標記物即S100A6基因甲基化和組蛋白變更體檢查顯示，這一由重亞硫酸鹽修飾的DNA序列長3247 bp，包含了啟動子/第一個外顯子CpG區(qū)域，S100A6基因的編碼序列和一段下游區(qū)域，該段序列顯示它們在S100A6表達陽性的細胞中呈現非甲基化，例如在淋巴細胞和人表皮樣癌(Hep-2),而在不表達S100A6的胚胎性上皮細胞(HEK293)中則表現為甲基化。運用染色質免疫沉淀法檢測出在組蛋白H3乙酰化和甲基化的水平上以及體內分別表達S100A6陽性和陰性的細胞中與S100A6基因啟動子結合的USF數量上都存在差異。由此證明，S100A6的細胞特異性表達也是在外遺傳控制的機制下進行的[7]。

1.3 S100A6蛋白功能

S100蛋白成員是多功能信號蛋白，參與調控多種細胞的活動。細胞內的S100蛋白可增強物質代謝(作用于肌球蛋白重鏈)、促進細胞骨架的解聚作用(作用于微管蛋白)，參與胞吞作用和胞吐作用，調節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性，影響轉錄。細胞產生的S100蛋白分泌到細胞外可以激活鈣離子通道，增強趨化效應，促進細胞外基質蛋白相互作用[8]。S100A6與S100蛋白家族其他成員間存在結構上的同源性，因此，S100A6也參與這些過程。

S100A6還具有調控蛋白的磷酸化和促進細胞凋亡的作用。CacyBP是S100A6的靶蛋白之一，它與S100A6結合呈Ca2+依賴的形式。最新的研究發(fā)現，一種新的酵母蛋白Sgt1與CacyBP有20%的同源性，其中C末端與CacyBP相似，是S100蛋白結合部位[9]。在酵母中Sgt1可以與Skp1(SCF泛素連接酶和著絲粒復合物的成分之一)結合，Sgt1結合的SCF復合物包括β-TrCP蛋白，是β-catenin降解的經典泛素連接酶復合物(SCFβ-TrCP)。S100蛋白能與Sgt1結合，Sgt1的S100結合域可以被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化，而S100A6的結合能抑制這種磷酸化，所以S100A6對Sgt1磷酸化的調控可能是S100-Sgt1相互作用的生理功能[10]。為闡明S100A6在細胞凋亡過程中的作用，構建含有S100A6基因模板鏈或反義鏈的質粒載體轉染體外培養(yǎng)的Hep3G細胞后，Ca2+載體處理劑A23187處理細胞誘導凋亡條件，發(fā)現S100的過表達使Hep3G對處理劑誘導的細胞凋亡更加敏感[11]。與此相反，與無處理對照組細胞或轉染有S100A6基因模板鏈質粒的陽性細胞相比，轉染有S100A6反義鏈質粒的細胞細胞存活力較高，DNA斷裂程度較低，G1期/G0期細胞數降低。同一實驗還發(fā)現與無處理組細胞相比，陽性表達S100A6的Hep3G細胞中細胞凋亡相關分子Caspase-3(半胱天冬酶-3)活性增強，而在表達S100A6陰性細胞中活性降低。這說明S100A6表達增多通過增強Caspase-3活性影響誘導細胞的細胞凋亡。進一步運用RT-PCR,Western-blot和Caspase-3啟動子分析檢測發(fā)現隨著S100A6含量水平增高，Caspase-3表達水平也呈一定比例增高，而其他凋亡相關因子如Caspase-6，Caspase-7，Caspase-8，Caspase-9，Bcl-2，Bax等表達水平未見差異性變化。以上結果均暗示，S100A6可能以Caspase-3轉錄活化劑的形式參與促進了細胞凋亡。

2 S100A6與腫瘤

2.1 S100A6在腫瘤中異常表達

在大多數腫瘤組織中S100A6表達均有增高[12]，它的異常表達與細胞的增殖和分化密切相關，當靜止細胞在生理或病理條件下受到血清、表皮生長因子、血小板源生長因子、神經生長因子、視黃酸、缺血性損傷等刺激時，胞內S100A6的表達會有顯著的升高[13]。據文獻報道，在ras轉化的NIH3T3細胞、SV4O轉化的鼠成纖維細胞、人急性粒細胞白血病、人子宮內膜癌、乳腺癌、肺癌、結直腸腫瘤、甲狀腺腫瘤、惡性纖維組織瘤、黑色素細胞瘤、神經母細胞瘤、口腔黏膜的鱗狀細胞癌、各種類型的皮膚腫瘤以及上皮來源的腫瘤細胞系等多種增殖旺盛的細胞中，S100A6均高表達[14]，高于同種的分化/生長受抑的細胞。眾多研究表明，與S100A6相關的幾種蛋白質，包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶、原肌球蛋白、P30、膜聯蛋白Ⅺ等，與S100A6相互作用形成的復合物參與細胞的增殖。

2.2 S100A6與腫瘤轉移的關系

現今S100A6在黑色素瘤和結直腸腫瘤中表達異常的研究較多。Maelandsmo等[15]報道，S100A6的mRNA、蛋白表達水平在人轉移黑色素瘤中一般高于良性痣，但在這兩種組織中S100A4沒有明顯差別，故被認為是黑色素瘤細胞的腫瘤標記物。S100A6的高表達還與黑色素瘤細胞的轉移能力呈正相關，并與患者存活期相關，低表達患者存活時間明顯長于高表達患者。Komatsu等[16]報道，S100A6在轉移性結直腸腺癌細胞中的表達是可逆的，當癌細胞在轉移結節(jié)中心重新構建細胞與細胞之間的聯結后，其表達水平下降。S100A6、S100A8、S100A9多聚集于腫瘤的邊緣，故推測它們可能與腫瘤的侵襲性有關。Vimalachandran等[17]證實，胰腺癌患者的腫瘤細胞核內高度表達S100A6 與其低生存率密切相關。但Hue等[18]研究S100A6與人骨肉瘤的關系時發(fā)現，高度表達的S100A6能限制腫瘤的轉移，并抑制腫瘤細胞的成長，這一點似乎與以往的研究結果有所出入。

他們的研究還證實，高度表達S100A6的骨肉瘤患者其生存時間遠比低表達S100A6 的生存時間長，其中潛在的機制尚未被闡明。看來S100A6在腫瘤中的表達與腫瘤的轉移性之間的關系需要進一步的研究。

3 S100A6與細胞信號轉導

3.1 S100A6調節(jié)Sgt1與Hsp70和Hsp90的相互作用

Sgt1作為一種在與Skp1蛋白相互作用過程中能夠活化CBF3著絲粒和SCF泛素連接酶復合體的蛋白由Kitagawa等人首先在酵母中發(fā)現[19]。Sgt1蛋白由三個主要結構域組成，即Sgt1的C端部分，N端部分和中心部分。其C端部分也稱為SGS區(qū)域，這一區(qū)域在其所有亞型和同系物Cacy-BP/SIP中的表達都是統(tǒng)一的。人類Sgt1蛋白的SGS區(qū)主要用來與S100家族中的一些鈣離子結合蛋白相互作用[20]。Sgt1蛋白的N端包含了TPR區(qū)，此區(qū)在除Sgt1之外的其它蛋白中與某些分子伴侶蛋白相互作用[21]。事實上，研究顯示Sgt1的N端部分主要參與與Hsp90的結合[22-23]。Sgt1的中心部分稱為CS區(qū)，用于與其它一些CS區(qū)包含蛋白相互作用[24]。最近文獻報道，人類Sgt1蛋白的CS區(qū)在體內與分子伴侶蛋白Hsp90相互作用而不是TPR區(qū)[25]。分子伴侶作為一種主要驅動蛋白在許多細胞性活動中如蛋白質折疊與成熟，蛋白水解，DNA復制和轉錄中發(fā)揮重要作用。Hsp70型分子伴侶參與對天然蛋白構象的穩(wěn)定過程以及部分已折疊蛋白質在順應應激條件下的重折疊和解聚過程[26]。Hsp90的功能雖然較Hsp70來說比較局限，但已證實它在保護蛋白抵抗外來應力的過程中發(fā)揮了重要作用[27-28]。

為研究Sgt1能夠與包含Hsp90在內的其它分子伴侶蛋白相互作用，分別運用三種不同的檢測方法進行實驗：免疫共沉淀法，親和層析法和ELISA法。運用免疫共沉淀法在轉染了編碼Sgt-FLAG質粒的HEP-2細胞用配有抗-FLAG抗體的瓊脂糖免疫沉淀Sgt1-作用蛋白，洗脫蛋白聯合體，在SDS膠上進行分離，分別用抗FLAG標簽抗體，抗Hsp70抗體，抗Hsp90抗體對其進行免疫印記分析。結果顯示，Hsp70和Hsp90都與Sgt1相互作用而被沉淀下來，同時，在陰性對照細胞以及轉染了只編碼FLAG標簽質粒的細胞中，由于非特異性結合顯示較明顯的背景染色。值得注意的是，在用Hsp90抑制劑-radicicol孵育的細胞中，未見Hsp90條帶，而Hsp70條帶卻更加明顯。運用親和層析法通過對HEp-2細胞提取物中上清液進行分離，以不做任何處理和用radicicol進行處理作為兩種樣本都運用于加有Tris以封閉非特異性結合的瓊脂糖凝膠樹脂，未聯合部分運用于含有Sgt1的瓊脂糖樹脂。結果顯示，不管在未處理細胞還是用radicicol處理過的細胞中，Hsp70都能與瓊脂糖凝膠中的Sgt1結合，而Hsp90蛋白只在未處理細胞的洗脫液中檢測到。運用ELISA法將重組蛋白Hsp70或Hsp90包被于96孔板中，逐步加入重組蛋白Sgt1，抗Sgt1抗體后對反應液進行色度分析。結果顯示，Hsp70和Hsp90的α和β亞基與Sgt1蛋白相互作用。以上三種不同檢測方法均證明，Sgt1與分子伴侶蛋白Hsp70存在相互作用。

早期研究發(fā)現，Sgt1的C端即SGS區(qū)，存在263～333個氨基酸殘基，能夠以一種Ca2+依賴方式與S100A6結合[21]。為研究S100A6對Sgt1-Hsp90和Sgt1-Hsp70相互作用的調節(jié)，分別對轉染有編碼Sgt1-FLAG質粒的細胞和轉染有編碼S100A6質粒的細胞提取蛋白，用配有抗-FLAG標簽抗體的瓊脂糖凝膠對兩種細胞蛋白做免疫沉淀檢測。結果顯示，S100A6的過表達或表達增高降低了與Sgt1蛋白結合的Hsp90和Hsp70的結合量。用經鈣離子螯合劑BAPTA/AM處理過的細胞做同樣實驗發(fā)現，與Sgt1蛋白結合的Hsp90或Hsp70的量與轉染有只編碼Sgt1-FLAG質粒的細胞和轉染編碼S100A6基因質粒的細胞中結合Sgt1的Hsp90，Hsp70蛋白量相近。這個結果暗示了S100A6通過Ca2+依賴方式結合到Sgt1的C端從而調節(jié)Sgt1與分子伴侶蛋白的相互作用。

3.2 S100A6能夠增強Wnt/β-catenin信號途徑的活性

Wnt/β-catenin信號途徑的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，但其異常激活的機制尚未闡明。為了解Wnt/β-catenin信號途徑失調的原因和機制，人們開始研究β-catenin及其上游基因的調控機制[29-31]。

將含有人S100A6基因的pHAHA—hS1006質粒中的hS100A6亞克隆到pGST-Moluc和pAdTrack-CMV中，構建pGST-Moluc-hS100A6 和 pAdTrack-CMV-hS1006，用pGST-Moluc-hS100A6轉化表達宿主大腸桿菌BL21，誘導表達和分離純化該融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。 用空載體pGST-Moluc同時制備GST融合蛋白作為對照。結果顯示，誘導后重組菌的總蛋白經SDS-PAGE后，分別在36 000和26 000處有一條明顯增粗的條帶且與GST一S100A6融合蛋白和GST的分子量相符，谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠混懸液親和層析分離純化，測定蛋白純度為92%。

接種人骨肉瘤細胞株MG63和結腸癌細胞株HCT116細胞于12孔板，待細胞融合達50%～60%時，加入表達有hS100A6的重組腺病AdS100A6(以AdGFP為對照)，熒光顯微鏡下觀察腺病毒感染率，并分別于48、72 h收集細胞。SDS-上樣緩沖液裂解細胞，離心收集裂解液上清，紫外分光法進行蛋白定量后行SDS-PAGE和Western blot分析。分別加入一抗兔抗人β-catenin多克隆抗體(1：500)和β-actin(1：200)，二抗羊抗兔IgG(1：5000)。ECL試劑盒檢測結果，Gel Doc凝膠成像儀采集圖像，定量分析軟件測定各條帶灰度值。Western blot結果顯示，在AdS100A6感染48、72 h后，MG63和HCT116細胞中β-catenin的表達均較對照組明顯增加；同時，以β-catenin為內參對照，進一步驗證AdS100A6作用HCT116細胞48 h后β-catenin變化，該組灰度值是對照組的2.1倍。提示S100A6能增加MG63和HCT116細胞β-catenin的水平。

將人胚胎腎細胞株HEK293細胞接種于12孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞融合度達70%～80%時，用脂質體PolyFect將報告子基因質粒pTOP—Luc轉入細胞中，16 h后分別加入終濃度為40 μg/mL的GST-S100A6和GST，36 h后收集細胞裂解液上清進行蛋白定量。取總蛋白為20 μg的細胞裂解液上清與100 μL熒光素酶檢測試劑反應，以pFop-luc為陰性對照，用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性，并以此來反映細胞內轉錄復合物β-catenin/T細胞因子4(TCF4)的轉錄活性[30]。結果顯示，GST-S100A6能夠增加轉染Ptop-Luc的HEK293細胞的熒光素酶活性20.2倍，但對轉染Pfop-Luc的HEK293細胞的熒光素酶活性無影響，且GST對照組與空白對照HEK293細胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義。提示S100A6能夠特異性上調β-catenin/TCF4的轉錄活性。

電穿孔法分別將質粒pcDNA-GSK-3β-HA、pCMV-Dvl-Myc和pCMV-Axin-Myc轉染對數生長期的HEK293細胞，培養(yǎng)36 h后收獲富含GSK-3β-HA、Dv-Myc和Axin-Myc的細胞裂解液上清；直接裂解HEK293細胞獲得含β-catenin的細胞裂解液上清。細胞裂解液上清均用谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠進行預清潔，以清除與球珠非特異吸附的蛋白。預清潔后的細胞裂解液上清各100 μL與10 μg GST—hS100A6在冰浴中孵育1 h后加入15 μL谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠，在冰浴中翻轉搖動孵育3 h，4℃離心收獲球珠，洗滌3次后加入等體積1倍的SDS-上樣緩沖液，煮沸5 min，進行SDS-PAGE和Western blot分析。以GST為陰性對照，以富含GSK-3B-HA、Dv1-Myc、β-catenin和Axin-Myc的細胞裂解液上清為陽性對照。結果顯示，各陽性對照組，GST-S100A6-β-catenin組，GST-S100A6-GSK-3β-HA組和GST-S100A6-Dvl-Myc組均有特異性雜交條帶出現；而GST-S100A6-Axin-Myc組和各GST對照組則未出現特異性條帶。提示S100A6與β-catenin，GSK-3β和Dvl在體外可能存在著某種直接的相互作用，而與Axin之間并無直接相互作用。由此推測，S100A6與β-catenin的直接相互作用可能會直接抑制β-catenin的降解，導致其在胞漿內的水平增加，從而使Wnt/β-catenin信號途徑活性[32-33]的活性增強；在人類腫瘤中，尚未檢測到GSK-3β的基因突變，但其活性可下調。對于S100A6與其的直接相互作用可能是通過實現對其活性的調節(jié)，從而抑制β- catenin的磷酸化，使β-catenin降解受阻而致胞漿內水平增加。Dvl蛋白是該信號的正性調節(jié)因子，具有DIX，DEP和PDZ三個結構域，其中PDZ域能與EF手型基序以鈣非依賴方式結合[34-35]，這可能是Dvl與S100A6之間直接相互作用的結構基礎。這種相互作用可能通過促進Dvl的功能，從而抑制β-catenin的磷酸化依賴性降解，導致Wnt/β-catenin信號途徑的活性增強。

β-catenin是Wnt/β-catenin信號途徑中的關鍵分子，其在胞漿內的表達水平決定著β-catenin/TCF-4的轉錄調節(jié)活性，從而影響著該信號途徑的活性。結腸腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)，GSK-3β，Axin和Dvl可調節(jié)細胞內β-catenin的磷酸化依賴性降解水平，其中前三者是促進降解，后者是抑制降解。由于這些分子的異常表達所導致的β- catenin磷酸化依賴性降解受阻，使胞漿內β-catenin累積并進入細胞核內與TCF4結合，從而使β-catenin/TCF4的活性增高，信號途徑活性增強[34-35]。S100A6能增加β-catenin的表達水平并上調β-catenin/TCF4活性，提示S100A6具有增強Wnt/β-catenin信號途徑活性的作用，這可能正是S100A6參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制之一。

4 展 望

S100A6作為一種鈣結合蛋白，在細胞信號轉導過程中發(fā)揮重要作用，盡管對其性質以及結構等方面有了一定的了解，但不夠全面，在以后的研究中有待進一步拓展，特別是在細胞增殖、凋亡，腫瘤發(fā)生、浸潤和轉移等過程中的生物學作用機制；與S100蛋白家族中其他成員的關聯和相互協同作用；利用反義核酸技術阻斷S100A6的表達是否可以抑制腫瘤的轉移和復發(fā)；靶蛋白分子的鑒定等方面。隨著蛋白質組學方法、生物信息學工具以及基因芯片、RNA干擾、小RNA等分子生物學技術的應用及改進，S100A6基因的表達和生物學功能會逐步明朗化，有望應用于腫瘤及其轉移的早期檢測、診斷和治療。

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