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    非接觸調(diào)頻模式AFM的發(fā)展及生物學應用

    2012-03-22 02:42:28張金金
    核技術(shù) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:針尖磷脂調(diào)頻

    李 林 張金金 胡 鈞

    (中國科學院上海應用物理研究所 上海 201800)

    原子力顯微鏡(AFM)是用探針針尖和樣品表面原子間的范德華力呈現(xiàn)樣品表面特征的掃描探針顯微鏡,能對金屬、半導體和絕緣體表面進行成像。在材料科學領(lǐng)域,AFM為了解材料的表面形貌特征提供了直接依據(jù);在生物領(lǐng)域,AFM對不同環(huán)境下生物分子結(jié)構(gòu)在納米尺度上的成像發(fā)揮了重要作用[1–3]。AFM的成像模式有接觸模式、輕敲模式和非接觸調(diào)頻模式。非接觸調(diào)頻模式AFM具有分子和原子級別的成像分辨能力[4,5],樣品幾乎不受到影響和損傷,即使對軟物質(zhì)表面也能進行高分辨成像,從而使AFM的應用跨前了一步。

    1 非接觸調(diào)頻模式AFM在真空中的高分辨成像

    非接觸調(diào)頻模式AFM的成像原理是:當探針靠近樣品表面時,由于范德華力的作用,探針懸臂的共振峰會發(fā)生偏移,探測該頻率偏移并維持其恒定,可進行反饋成像[5]。系統(tǒng)流程如圖1所示。非接觸調(diào)頻模式AFM的成像參數(shù)為探針懸臂振幅、成像頻率偏移和頻率偏移基準。為實現(xiàn)高分辨,通常先設(shè)定頻率偏移基準為零,再細微調(diào)節(jié)探針懸臂振幅和成像頻率偏移,優(yōu)化成像條件。須注意的是,探針懸臂振幅減小時,最大成像頻率偏移會增加。

    圖1 非接觸調(diào)頻模式AFM系統(tǒng)流程圖Fig.1 Schematics of non-contact frequency-modulation AFM.

    圖2(a)為掃描隧道顯微鏡(STM)對硅晶體(111)-(7×7)表面的成像圖(橫坐標為掃描范圍),每一硅晶格呈菱形,含有12個硅原子,菱形對角線分別為4.66和2.69 nm;圖2(b)是非接觸調(diào)頻模式AFM在真空中對該樣品表面的高分辨成像圖,圖像中上部可清晰分辨出單個硅原子和五個硅晶格,且每個晶格內(nèi)硅原子的排布情況與掃描隧道顯微鏡圖像一致。這也證實非接觸調(diào)頻模式AFM在真空中可實現(xiàn)對晶體表面原子級的分辨率。圖中分辨率較低的部位,由系統(tǒng)穩(wěn)定性和探針尖端的多針尖現(xiàn)象造成。掃描開始時是多針尖探針,成像分辨率不高;掃至中上部時,多針尖變?yōu)閱吾樇?,信噪比大大提高,從而實現(xiàn)了原子級的分辨率。表明雖然非接觸調(diào)頻模式AFM實現(xiàn)了在真空中對平整晶體表面的原子級分辨率成像,但將它應用于單個、起伏較大的單分子成像會遇到技術(shù)瓶頸,即系統(tǒng)的穩(wěn)定性和探針尖端的銳利程度。

    圖2 硅晶體(111)-(7×7)表面的STM圖像(a)和真空中非接觸調(diào)頻模式AFM圖像Fig.2 Images of Si(111)-(7×7) surface by scanning tunneling microscope (a), and by non-contact frequency-modulation AFM in vacuum(b).

    非接觸調(diào)頻模式AFM難以實現(xiàn)單分子的高分辨成像,這是因為單個分子在縱向上起伏較大,很易由于系統(tǒng)不穩(wěn)定導致探針針尖與樣品表面的接觸,使樣品變形甚至損壞,同時探針銳利的針尖也被破壞。最近,科研工作者將非接觸調(diào)頻模式AFM放入真空超低溫環(huán)境中,實現(xiàn)了單分子成像[6],由于溫度僅為5 K,探針懸臂的熱漂移非常小,系統(tǒng)穩(wěn)定性大大增強。另外,探針尖端吸附一氧化碳分子,可得到更銳利的尖端[7],從而避免出現(xiàn)多針尖,使成像過程中始終保持單針尖掃描樣品。同時,為達到高分辨成像,探針針尖與樣品表面必須十分接近,因此,探針懸臂得以非常小的振幅穩(wěn)定振動,須選擇懸臂彈性系數(shù)很大的探針進行成像。圖3(c)和(d)為非接觸調(diào)頻模式AFM在真空低溫環(huán)境下實現(xiàn)對銅(111)表面上五苯環(huán)的單分子超高分辨成像[6],與圖3(b)中掃描隧道顯微鏡對該樣品的成像圖像相比,具有更高的分辨率,可清晰分辨出組成每個苯環(huán)的各個原子。證實了非接觸調(diào)頻模式AFM在真空低溫下實現(xiàn)了對單分子的超高分辨成像,為其結(jié)構(gòu)研究提供了直接證據(jù)。

    圖3 五苯環(huán)模型(a)與五苯環(huán)的STM圖像(b),真空低溫下非接觸調(diào)頻模式AFM的單分子級分辨成像(c,d)Fig.3 Model (a) and STM image (b) of the pentacene molecule, and single molecule resolution of pentacene molecule by non-contact frequency-modulationAFM in vacuum and cryo-temperature (c,d).

    2 非接觸調(diào)頻模式AFM的溶液中高分辨成像

    非接觸調(diào)頻模式AFM的高分辨成像能力,且其探針與樣品間的相互作用力較小,故在生物學研究中的受到青睞,同時,為保持生物樣品(如磷脂雙分子層、蛋白質(zhì)等)的結(jié)構(gòu),需在生理環(huán)境中進行成像。

    AFM 的接觸模式和輕敲模式實現(xiàn)了對磷脂雙分子層、DNA、蛋白質(zhì)等生物樣品在溶液中的成像[8–13],為生物學研究提供了有用信息。但是,對單個生物大分子至今尚未實現(xiàn)納米/亞納米級分辨率的突破,其解析能力和應用范圍受到極大限制。對于接觸式 AFM,即便使用最軟的懸臂探針(彈性系數(shù)k ≈ 0.01 nN/nm),由于懸臂本身的熱噪聲和儀器本底噪聲,實現(xiàn)穩(wěn)定成像所需的力再小也得10–50 pN,而高分辨需很尖銳的探針,則形成的壓強很高。例如,若分辨率為1 nm,直接接觸的面積約1 nm2,若接觸力為10 pN,其壓強約為100大氣壓。自然狀態(tài)下的蛋白分子及生物樣品的楊氏模量較小,此壓強將導致生物樣品的巨大形變,甚至破壞生物分子結(jié)構(gòu);還將導致尖銳探針頂端損壞,降低系統(tǒng)的點分辨能力。這是接觸模式和輕敲模式AFM 無法對生物大分子獲得超高分辨率圖像的根本原因。

    基于非接觸調(diào)頻模式AFM較高的靈敏度、較小的探針與樣品間的接觸力,F(xiàn)ukuma等[14,15]發(fā)展了一套適合在生理環(huán)境中成像的非接觸調(diào)頻模式AFM系統(tǒng)。眾所周知,激光二極管的主要噪音來源于模跳躍(mode hopping),對于非接觸調(diào)頻模式AFM成像,尤其是微振幅操作,這個噪音造成震蕩回路偏離,直接導致系統(tǒng)失穩(wěn)。為了盡可能減小甚至消除此類噪聲,射頻干涉是有效方法之一。如圖4(a)所示,在激光驅(qū)動信號中耦合一個300 MHz的射頻信號,快速關(guān)閉激光二極管,從而減少模跳躍效應。前置處理電路中的帶通濾波器則減小電路噪聲,提高信噪比。通過硬件改進,非接觸調(diào)頻模式AFM 在溶液中對云母成像就能達到原子級分辨率[15](圖4b)。

    圖4 溶液中成像的非接觸調(diào)頻模式AFM系統(tǒng)圖(a)及其對云母的原子級分辨率圖像(b)Fig.4 Schematics of non-contact frequency-modulation AFM for imaging in solution (a) and the atomic resolution of mica by this system (b).

    3 非接觸調(diào)頻模式AFM在生物結(jié)構(gòu)研究中的應用

    常規(guī)模式AFM實現(xiàn)了大范圍磷脂雙分子層[12]、不同磷脂混合雙分子層[13]及磷脂雙分子層不同相變的成像[16],但對磷脂頭部排布結(jié)構(gòu)一無所知。非接觸調(diào)頻模式AFM在溶液中實現(xiàn)了對磷脂雙分子層DPPC的高分辨成像[17]。DPPC磷脂雙分子層由兩條十六個碳原子組成的碳鏈和一個磷脂頭部組成。如圖 5,每個磷脂頭部排布成六邊形形狀,通過A到B的長度和高度測量可知,磷脂頭部中心距離為0.49 nm。DPPC磷脂雙分子層磷脂頭部的結(jié)構(gòu)信息,為研究其功能提供了有力證據(jù)。

    非接觸調(diào)頻模式AFM在生理環(huán)境中實現(xiàn)了對單個蛋白大分子的高分辨成像[18,19]。我們知道,蛋白質(zhì)是細胞中的主要功能分子,發(fā)揮多種多樣的功能,如催化作用、參與生物體內(nèi)新陳代謝的調(diào)劑作用、運輸代謝物質(zhì)的作用等。而人類免疫球蛋白是對人體免疫功能有重要作用的一種蛋白質(zhì),對其結(jié)構(gòu)的解析具有重要意義[20,21]。圖6為非接觸調(diào)頻模式AFM在溶液中對人類免疫球蛋白IgM的高分辨成像[18],每一個分子呈中間凸出的結(jié)構(gòu),高度~6 nm,圖像分辨率~2 nm。表明非接觸調(diào)頻模式AFM可在溶液中對單個蛋白大分子實現(xiàn)高分辨成像,為它在生物結(jié)構(gòu)學的應用拓寬了道路。

    4 結(jié)論與展望

    非接觸調(diào)頻模式AFM的發(fā)展為我們在納米尺度上的研究提供了有用工具,也為生物結(jié)構(gòu)學的研究提供了直接依據(jù)。

    對于生物大分子結(jié)構(gòu),10?是一個非常重要的分辨率指標,蛋白大分子的二級結(jié)構(gòu),通常都需10?或稍高(亞納米)的分辨率才可明確解析。從這個意義上說,對于分辨率從15?增至10?,對于結(jié)構(gòu)生物學的意義就能成指數(shù)級上升,因為與機理相關(guān)的結(jié)構(gòu)變化及分子間的相互作用,大多在這個結(jié)構(gòu)層次上發(fā)生。所以,在生理條件下實現(xiàn)蛋白大分子以及細胞表面膜(生命科學中最具挑戰(zhàn)的復雜結(jié)構(gòu)之一)的納米/亞納米級高分辨率成像,是單分子結(jié)構(gòu)生物學的重要目標之一。相信不久的將來,通過儀器的發(fā)展,必然可對生物樣品實現(xiàn)10?以上的分辨率,從而對基礎(chǔ)生物學、新藥研發(fā)以及生物學核心科學命題作出貢獻,并進而發(fā)展成為結(jié)構(gòu)生物學中一個重要的普適技術(shù)方法。

    圖5 非接觸調(diào)頻模式AFM對DPPC磷脂雙分子層的高分辨成像(a) 在溶液中的成像圖,可分辨出單個磷脂頭部,(b), (c) 測量磷脂頭部中心距離為0.49 nmFig.5 The high resolution imaging of DPPC bilayer in solution by non-contact-frequency modulation AFM.(a) The high resolution image of DPPC bilayer in solution by non-contact frequency-modulation AFM. The single headgroup is seeable, (b, c) The central distance of two headgroups is 0.49 nm by lateral measurement.

    圖6 非接觸調(diào)頻模式AFM對人類免疫球蛋白IgM的高分辨圖像(a,c)以及IgM分子的中間凸起結(jié)構(gòu)(b,d)Fig.6 The high resolution images (a,c) of IgM by non-contact frequency-modulationAFM, and the measurement of IgM molecule higher central part structure (b,d).

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