趙玉萍 陳曉旺
(淮陰工學院生命科學與化學工程學院,江蘇 淮安 223003)
農(nóng)作物秸稈、稻殼和森林廢棄物在內(nèi)的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)是世界上最廣泛的可再生資源,是最具前景的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)原料。天然的纖維素物質(zhì)除了本身更加致密的晶體結(jié)構(gòu)外,一般還含有半纖維素和木質(zhì)素等,這些物質(zhì)“包裹”在纖維素外側(cè),形成了纖維素的天然屏障[1],因此利用木質(zhì)纖維素在技術(shù)上和成本上具有較大的挑戰(zhàn)。當前水解木質(zhì)纖維素主要有3條途徑:酸解法、酶解法和微生物降解法[2]。酸解法因?qū)Νh(huán)境污染大而較少應用,酶解法和生物水解法因其處理過程溫和、能耗低、設(shè)備要求低而備受關(guān)注[3]。據(jù)報道[4-7],降解木質(zhì)素的微生物有白腐真菌、褐腐真菌和軟腐真菌,其中白腐真菌以其酶活高、酶系完全成為研究的熱點。木質(zhì)素的降解主要依賴3種酶,即漆酶(Lac)、錳過氧化物酶(MnP)和木質(zhì)素過氧化物酶(LiP),其中漆酶是一種結(jié)合多個銅離子的多酚氧化酶,能催化各種芳烴類化合物(特別是酚類)的氧化[8]。由白腐真菌產(chǎn)生的漆酶因其來源廣泛、催化活性強而具有廣泛應用前景和價值,但因酶活不高,一直以來是研究的熱點[9]。
本試驗利用實驗室保藏白腐真菌,采用響面法優(yōu)化產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基提高酶活,為漆酶的進一步研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。
菌種:白腐真菌,本實驗室保藏。
超凈工作臺:BCM-1000,上海和呈儀器制造有限公司;
恒溫搖床:QYC-211,上海福瑪實驗設(shè)備有限公司。
(1)斜面培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基。
(2)種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g,硫酸銨3.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,KH2PO41.0g ,Na2HPO40.2 g,MnSO40.035g,CuSO4·5H2O 0.007g,吐溫-80 3mL,加蒸餾水至1 000mL。
(3)初始發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:麩皮10g,葡萄糖10g,硫酸銨0.1g,MgSO4·7H2O 0.5g,KH2PO41.0g,Na2HPO40.2g,MnSO40.035g,CuSO4·5H2O 0.007g,吐 溫-80 3mL,加蒸餾水至1 000mL[10]。
1.3.1 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量均為100mL/250mL三角瓶,搖瓶中加入10顆玻璃珠。搖床條件均為28℃、150r/min。種子培養(yǎng)時間為24h,接種量為10%。
1.3.2 酶活測定
(1)粗酶液制備:取發(fā)酵液8 000r/min離心10min,上清液即為粗酶液。
(2)漆酶活性測定:參照文獻[11]、[12]修改如下:4mL的反應混合液中,含有3.4mL 0.1mol/L的pH 4.0的醋酸鈉緩沖液,0.5mL 3.34mmol/L 甲苯胺,0.1 mL 適當稀釋的酶液,于40℃下反應5min,測600nm 處的OD 值,1個酶活單位用每分鐘OD 值增加0.1來表示。
根據(jù)上述培養(yǎng)條件,采用起始產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶,測定漆酶酶活,其酶活變化曲線見圖1。
圖1 起始發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中漆酶酶活曲線Figure 1 Laccase activity curve of original enzyme production medium
由圖1 可知,菌株發(fā)酵至13 d 時酶活達到最高22.5U/mL。
研究不同氮源對產(chǎn)酶的影響,氮源濃度及其它條件均同發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。分別以(NH4)2SO4、酒石酸銨、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏作為不同的氮源作產(chǎn)酶研究。最大酶活測定結(jié)果見圖2。
由圖2可知,發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳氮源為酒石酸銨,其酶活可達26.4U/mL。
圖2 不同氮源對酶活的影響Figure 2 Effect of difference nitrogen sources on Lac activity
從麩皮、葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅、吐溫-80 這9 種因素,進行單因素試驗,初步篩選出對菌株產(chǎn)酶影響較大的3種因素,然后通過Design-Expert軟件進行三因素三水平的試驗,根據(jù)軟件所提供的各種條件進行試驗。
在原有發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,在其它因素不變的情況下,僅對麩皮添加量進行單因素試驗,其添加量分別為5.0,7.5,10.0,12.5,15.0g/L,測定酶活。依據(jù)相同的方法作其它單因素試驗,分別改變葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅和吐溫-80的添加量,結(jié)果見圖3~5。
圖3 不同質(zhì)量麩皮、葡萄糖和酒石酸銨對Lac酶活的影響Figure 3 Effects of difference concentrations of wheat bran,glucose and ammonium tartrate on Lac activity
圖4 不同質(zhì)量磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和硫酸鎂對Lac酶活的影響Figure 4 Effects of difference concentrations of KH2PO4,Na2HPO4and MgSO4on Lac activity
由圖3~5可知,麩皮、酒石酸銨、吐溫-80 3種物質(zhì)對酶活影響較大,其它因素影響不明顯,確定麩皮、酒石酸銨和吐溫-80為主要影響因素。
根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理,進行三因素三水平的響應面分析試驗。試驗設(shè)計因子水平見表1,試驗設(shè)計矩陣和結(jié)果見表2。
利用Design-Expert軟件對表中試驗數(shù)據(jù)的二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合,以發(fā)酵液漆酶酶活為響應值Y,其結(jié)果見表3。
圖5 不同質(zhì)量硫酸錳、硫酸銅和吐溫-80對Lac酶活的影響Figure 5 Effects of difference concentrations of MnSO4,CuSO4and Tween-80on Lac activity
表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因子水平表Table 1 Levels of the variables in the Box-Behnken experimental design
回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由F 檢驗來判定,P值越小,則相應變量的顯著程度越高。由表3可知,一次項系數(shù)X1、X2、X3,二次項系數(shù)X21、X22、X23,交互項系數(shù)X1X3的P 值均小于0.05,說明這些因素對菌株發(fā)酵產(chǎn)漆酶酶活影響顯著。而交互項X1X2、X2X3的P 值均大于0.05,說明X1與X2、X2與X3之間的相互作用小,對發(fā)酵生產(chǎn)漆酶酶活影響不顯著。經(jīng)過對試驗數(shù)據(jù)的回歸分析,得到二次多元回歸方程:
表2 響應面法設(shè)計矩陣和結(jié)果Table 2 Design matrix and results of response surface methodology
表3 漆酶的方差及顯著性分析結(jié)果Table 3 Variance and significance analysis of Lac activity
由表3可知,復相關(guān)系數(shù)R2=96.74%,說明響應值的變化有96.74%來源于所選變量。因此該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關(guān)系,可以利用該回歸方程對本試驗產(chǎn)木質(zhì)素酶降解菌株發(fā)酵產(chǎn)酶進行分析和預測。
根據(jù)響應面回歸方程利用Design-Expert軟件繪制的響應曲面圖和等高線圖,見圖6~8。
圖6 麩皮和酒石酸銨對漆酶表達的響應面與等高線圖Figure 6 Response surface and corresponding contour plot(wheat bran,ammonium tartrate)
每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用。由圖6~8可知,麩皮、酒石酸銨和吐溫-80與漆酶產(chǎn)量存在顯著的相關(guān)性。當酒石酸銨和吐溫-80維持固定在最佳水平時,麩皮的添加量由7.50g/L 升至11.04g/L 時,漆酶產(chǎn)量隨之升高,當超過11.04g/L時,漆酶產(chǎn)量開始下降。同時,由相應的等高線圖可以看出,麩皮和酒石酸銨、吐溫-80和酒石酸銨、麩皮和吐溫-80 的等高線均呈橢圓形,交互作用顯著。
為確定本試驗產(chǎn)纖維素酶菌株最佳的發(fā)酵條件,根據(jù)Design-Expert軟件分析和預測,獲得漆酶酶活最大值時,主要因素麩皮、酒石酸銨和吐溫-80 的優(yōu)化值分別為11.04,0.10g/L和3.24mL/L。根據(jù)模型的預測,菌株在優(yōu)化后的條件下發(fā)酵產(chǎn)生Lac酶酶活最大值為34.25U/mL。
圖7 吐溫-80和酒石酸銨對漆酶表達的響應面與等高線圖Figure 7 Response surface and corresponding contour plot(Tween-80,ammonium tartrate)
圖8 麩皮和吐溫-80對漆酶表達的響應面與等高線圖Figure 8 Response surface and corresponding contour plot(Tween-80,wheat bran)
為檢驗模型預測值與實際試驗值之間的相關(guān)性,即檢驗響應面優(yōu)化模型的可靠性,對菌株在預測的最優(yōu)條件下發(fā)酵產(chǎn)酶能力進行實驗驗證,測得其發(fā)酵后的Lac 酶酶活為36.67U/mL,與預測值十分接近。優(yōu)化后酶活與比優(yōu)化前提高了62.98%。
本試驗采用白腐真菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶,利用Design-Expert軟件在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過響應面分析影響漆酶酶活的主要因素為麩皮、酒石酸銨和吐溫-80,研究了在最優(yōu)條件下,Lac酶的最大酶活可達36.67 U/mL,比優(yōu)化前提高了62.98%,證明該方法提高漆酶酶活切實可行。
1 Jonatas S R,F(xiàn)lavio A R.Cements obtained from rice hull:encapsulation of heavy metals[J].Journal of Hazardous Material,2008,154(15):1 075~1 080.
2 Sharma A,Khare S K,Gupta M N.Hydrolysis of rice hull by crosslinked Aspergillus niger cellulose[J].Bioresource Technology,2001,78(3):281~284.
3 Badal C S,Michael A C.Enzymatic saccharification and fermentation of alkaline peroxide pretreated rice hulls to ethanol[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,41(4):528~532.
4 Bumpus J A,Aust S D.Biodegradation of environmental pollutants by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium:Involvement of the lignin degrading system[J].Bioessays,2005,6(4):166~170.
5 Gupte A,Huttermann A,Majcherczyk A,et al.Ligninolytic enzyme production under solid state fermentation by white-rot fungi[J].Journal of Scientific and Industrial Research,2007,66(8):611~614.
6 Liang J F,Huang H S,Zhang K Q,et al.Study on the screening of the lignin-degrading fungus and the degradation of straws[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2009,24(5):206~209.
7 Patel H,Gupte A,Gupte S.Laccase from Pleurotus ostreatus HP-1[J].Bioresources,2009,4(1):268~284.
8 巫小丹,徐爾尼,劉玉環(huán),等.產(chǎn)漆酶綠色木霉的篩選、鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2012,33(7):165~169.
9 趙世光,王詩然,薛正蓮,等.Ganoderma lucidum UIM-281產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件的篩選及響應面優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(11):72~77.
10 郁紅艷,曾光明,黃國和,等.木質(zhì)素降解真菌的篩選及產(chǎn)酶特性[J].應用與環(huán)境生物學報,2004,10(5):639~642.
11 吳涓,肖亞中,王怡平,等.蜜環(huán)菌胞外漆酶酶活力的分光光度法測定[J].廈門大學學報,2011,40(4):893~898.
12 張?zhí)锾?,沈明?Plackett-Burman設(shè)計和響應面法優(yōu)化火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基[J].食品工業(yè)科技,2011,32(9):223~226.