斑點(diǎn)叉尾鮰魚腸蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

黃麗洋,丁建君,姜山,楊杰,陳煒,胡建恩

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

斑點(diǎn)叉尾鮰魚腸蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

黃麗洋,丁建君,姜山,楊杰,陳煒,胡建恩

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

以斑點(diǎn)叉尾鮰Ictalurus punctatus魚腸道為原料提取蛋白酶,對(duì)分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:魚腸內(nèi)的蛋白酶在硫酸銨飽和度為70%時(shí),所得沉淀中酶活力最高。經(jīng)過陰離子交換層析分離后,蛋白酶的純化倍數(shù)達(dá)到了218倍。該蛋白酶的最適溫度為55℃,最適pH為7.5,具有良好的低溫穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性,米氏常數(shù)為5.4 g/L。K+和Ca2+離子對(duì)該蛋白酶活性有較弱的激活作用,Mg2+則能顯著激活蛋白酶活性;Na+和Zn2+對(duì)蛋白酶的活性有較弱抑制作用,而Cu2+和EDTA能顯著抑制蛋白酶活性。

斑點(diǎn)叉尾鮰;魚腸;蛋白酶;分離純化

斑點(diǎn)叉尾鮰Ictalurus punctatus原產(chǎn)于美國(guó)密西西比河,其肉質(zhì)鮮美,現(xiàn)已成為中國(guó)淡水養(yǎng)殖種類之一[1]和大宗出口加工魚類之一。而加工過程中產(chǎn)生的魚肚是高檔食材,卻作為廢棄物處理,造成了環(huán)境的污染。動(dòng)物性蛋白酶由于受原料限制,一直產(chǎn)量低、價(jià)格高。為此,本研究中,作者以斑點(diǎn)叉尾鮰的腸道為原料提取蛋白酶,對(duì)分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,旨在將廢棄的魚加工副產(chǎn)物作為生物制劑的原料。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮的斑點(diǎn)叉尾鮰魚腸由江蘇鹽城海天水產(chǎn)品有限公司提供,預(yù)處理前在-20℃下保存?zhèn)溆?。主要試劑有酪蛋白、牛血清蛋白、L-酪氨酸等,均為分析純。主要儀器有Toyopearl DEAE650-M陰離子交換樹脂、高速冷凍離心機(jī)、冷凍干燥機(jī)、紫外檢測(cè)儀、自動(dòng)收集器、蠕動(dòng)泵等。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 取斑點(diǎn)叉尾鮰魚腸道,除去污物后用去離子水洗凈,稱重,按質(zhì)量與體積比為1∶2加入Tris-HCl(4℃,pH為7.5、0.05 mol/ L)緩沖液,用高速組織搗碎機(jī)搗碎,在4℃下離心(14 000×g)20 min,取上清液,按體積比為1∶4加入正丙醇(4℃),攪拌均勻后于4℃下靜置4 h,離心(14 000×g)20 min,收集上清液即為粗酶液。

1.2.2 硫酸銨的分級(jí)沉淀 取粗酶液,加入硫酸銨使其飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%,攪拌均勻后在4℃下靜置30 min,離心(14 000×g)20 min,去上清液得沉淀,溶解后測(cè)定不同飽和度下的蛋白酶活性,透析24 h后保存?zhèn)溆肹2]。

1.2.3 蛋白酶的分離純化 經(jīng)70%硫酸銨沉淀以及透析后的粗酶液,用DEAE650-M陰離子交換柱分離,以去離子水和NaCl溶液(1 mol/L)進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,5 mL/管,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,透析脫鹽后測(cè)定蛋白酶活性,收集活性峰溶液。

1.2.4 蛋白酶活性的測(cè)定 用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶的活性,標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用L-酪氨酸法進(jìn)行。在40℃下,酶每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用Lowry法和分光光度法進(jìn)行測(cè)定,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)[3-6]1)酶的最適作用溫度。將粗酶液分別于30、40、50、55、60、70℃下反應(yīng),測(cè)定蛋白酶活力。

2)酶的熱穩(wěn)定性。將粗酶液分別于30、40、50、55、60℃恒溫條件下保溫15、30、45、60、90 min,測(cè)定蛋白酶活性。

3)酶的最適pH。用pH值分別為6、7、7.5、8、9、10的緩沖液配制酪蛋白溶液,測(cè)定不同pH條件下的蛋白酶活性。

4)酶的酸堿穩(wěn)定性。用pH值分別為3、4、5、6、7、7.5、8、9、10的緩沖液處理粗酶液,4℃條件下靜置4 h后,測(cè)定其蛋白酶活性。

5)酶的米氏常數(shù)。取粗酶液5份,分別與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的酪蛋白溶液于55℃、pH為7.5條件下反應(yīng),測(cè)其吸光度,由底物濃度、酶活力對(duì)應(yīng)吸光值,用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖。

6)金屬離子和EDTA對(duì)酶活性的影響。在粗酶液中分別加入K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+和EDTA,使其終濃度為10 mmol/L,4℃下靜置4 h后,測(cè)定在金屬離子及EDTA存在下的蛋白酶活性。以未添加金屬離子和EDTA的粗酶液的酶活力為100%計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨的分級(jí)沉淀

斑點(diǎn)叉尾鮰魚腸蛋白酶的硫酸銨分級(jí)沉淀中,硫酸銨飽和度為20%、30%時(shí)測(cè)不到蛋白酶的活性;飽和度為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)蛋白酶的活性分別為257、370、428、1 773、624 U/mg。表明硫酸銨飽和度大于60%時(shí),沉淀中的蛋白酶活性顯著,其中以飽和度為70%時(shí)活性最高;而硫酸銨飽和度低于30%時(shí),蛋白酶活性不顯著。

2.2 蛋白酶的分離純化

魚腸蛋白酶經(jīng)硫酸銨沉淀后的樣品再經(jīng)DEAE650-M陰離子交換層析純化(圖1),出現(xiàn)6個(gè)280 nm吸收峰,分別測(cè)定其蛋白酶活性和蛋白質(zhì)含量。酶比活力測(cè)定結(jié)果顯示:峰Ⅲ和峰Ⅳ所含蛋白酶的比活力比較高,分別為374、257 U/mg。

圖1 經(jīng)70%硫酸銨沉淀粗酶液的DEAE650-M陰離子交換層析圖譜Fig.1 Chromatogram of crude enzyme solution with 70%(NH4)2SO4by DEAE650-M exchange chromatography

如表1所示,鮰魚腸蛋白酶經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE650-M陰離子交換層析、冷凍干燥等處理后,其比活力由粗酶液中的350 U/mg提高到3 920 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)到218。

表1 魚腸蛋白酶的分離純化步驟與酶活力Tab.1 The data on purification of fish intestine protease and its activity

2.3 蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 酶的最適作用溫度 從圖2可見,在所測(cè)定的溫度范圍內(nèi),酶的最適作用溫度為55℃。

2.3.2 酶的熱穩(wěn)定性 從圖3可見,低溫下蛋白酶的穩(wěn)定性較好。在55℃下,保溫60 min后,酶活力仍保留50%左右;而在30、40℃下,保溫90 min后,酶活力仍可保留60%以上。

2.3.3 酶的最適pH 由圖4可見:pH為7.5時(shí)酶活力達(dá)到最高,其后隨著pH的增大而逐漸降低,pH小于7時(shí)酶活力急劇下降。

圖2 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on activity of protease

圖3 蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 Effect of temperature on stability of protease activity

圖4 pH對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of pH value on activity of protease

2.3.4 酶的酸堿穩(wěn)定性和酶的米氏常數(shù)Km 從圖5可見:在pH為7.5～10時(shí),酶活力可以保持在60%以上,酶的穩(wěn)定性良好。

從圖6可見:當(dāng)酶以酪蛋白為底物時(shí),Km值為5.4 g/L。表明該蛋白酶與酪蛋白的親和力較強(qiáng)。2.3.5 金屬離子和EDTA對(duì)蛋白酶活性的影響不添加任何物質(zhì)的粗酶液以及添加金屬離子K+、Mg2+、Ca2+、Na+、Zn2+、Cu2+和EDTA的粗酶液中,蛋白酶的相對(duì)酶活力分別為100%、107%、151%、119%、87%、65%、18%、26%。表明K+和Ca2+對(duì)蛋白酶活性有較弱的激活作用,而Mg2+則可以顯著激活蛋白酶活性;Na+和Zn2+對(duì)蛋白酶活性有較弱抑制作用,而Cu2+和EDTA則可以明顯抑制蛋白酶的活性。

圖5 酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.5 Effect of pH on stability of protease activity

圖6 酶催化酪蛋白水解的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)關(guān)系圖Fig.6 The Lineweaver-Burk plot of protease hydrolyzation catalysed

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Purification and characterization of protease from intestines of Ictalurus punctatus

HUANG Li-yang,DING Jian-jun,JIANG Shan,YANG Jie,CHEN Wei,HU Jian-en
(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The paper studies purification and characterization of protease from intestines of Ictalurus punctatus.The result demonstrates that protease has the maximum activity with 70%saturation(NH4)2SO4in crude extraction solution.By using ion exchange chromatography,protease is purified 218-fold.It further shows that the optimal temperature and pH is 55℃and 7.5 respectively for protease with optimal stability,and that Michaelis constant is 5.4 g/L.K+,Mg2+and Ca2+may enhance protease activity.Na+,Zn2+,Cu2+and EDTA may reduce protease activity.

Ictalurus punctatus;intestine;protease;purification

Q959.482

A

2095-1388(2012)01-0083-03

2011-03-14

黃麗洋(1985-),女,碩士研究生。E-mail:hly-824@163.com

胡建恩(1962-),男,教授。E-mail:hujianen@yahoo.cn