三七組織培養(yǎng)研究綜述

黃 勇，張 鐵，張文生，辛文鋒

（1.文山學(xué)院 生化系，云南 文山 663000；2.北京師范大學(xué)，北京 100875；3.云南省三七生物技術(shù)與制藥工程研究中心文山分中心，云南 文山 663000）

三七 [Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]又名田七，系五加科人參屬植物，享有“金不換”、“南國神草”、“人參之王”等美譽(yù)，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材。三七味甘、微苦、性溫，具有防治癌癥、抗衰老、抗疲勞、抗炎、降血壓、降血脂等多方面的藥理作用和保健功能，其主要藥理活性成分是皂苷，目前尚不能人工合成。三七對生長條件要求苛刻，全世界僅云南省文山州以及廣西部分地區(qū)適宜生長，加之生長周期長、病蟲害嚴(yán)重、連作障礙、農(nóng)藥殘留等問題，市場上三七資源供不應(yīng)求。通過組織培養(yǎng)技術(shù)，既可快速繁殖三七種苗，又可直接生產(chǎn)次生代謝物，是有效解決上述問題的途徑之一。本文將對國內(nèi)外三七組織培養(yǎng)研究進(jìn)展做一綜述。

1 愈傷組織誘導(dǎo)

在三七組織培養(yǎng)過程中，不管是進(jìn)行種苗快速繁殖，還是次生代謝物生產(chǎn)，愈傷組織的誘導(dǎo)是首要的重要步驟，在愈傷組織誘導(dǎo)中，外植體的選擇、激素的種類組合與濃度關(guān)系著組織培養(yǎng)效果的好壞甚至成敗。

1.1 外植體選擇

由于細(xì)胞具有全能性，故三七各器官均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率差異甚大。因此，篩選出愈傷組織誘導(dǎo)率高的器官作為三七組織培養(yǎng)的外植體至關(guān)重要。鄭光植等[1]研究表明：無論生長速率和干重增加、粗皂苷含量和產(chǎn)率、粗皂苷元含量、主要皂苷成分Rg1、Rb1和Rh1及其含量、皂苷組成還是誘導(dǎo)愈傷組織的頻率及速率，都以莖作為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織更為優(yōu)良。高先富等[2]認(rèn)為幼嫩花蕾愈傷組織是誘導(dǎo)不定根的理想材料。段承俐[3]用花藥作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，取得了較好的效果。由此可見：三七愈傷組織取材廣泛，可根據(jù)研究目的選用不同的外植體。一般情況下選用莖作為外植體會取得不錯(cuò)的效果；用幼嫩花蕾作為外植體有利于不定根的誘導(dǎo)；從事單倍體方面的研究則應(yīng)選用花藥作為外植體。

1.2 激素選擇

植物生長調(diào)節(jié)劑又稱植物激素，包括細(xì)胞分裂素、生長素等。細(xì)胞分裂素和生長素搭配使用可誘導(dǎo)植物脫分化形成愈傷組織，被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)。但不同的植物對植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度的反應(yīng)不盡相同。因此，需要篩選出適合三七愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合與濃度。目前，在三七組織培養(yǎng)中，用于愈傷組織誘導(dǎo)的生長素大多使用2，4-D，濃度一般為2 mg·L-1左右；搭配使用一定濃度的細(xì)胞分裂素效果更佳，目前大多使用KT，濃度一般為 0.5～0.7 mg·L-1[1-2，4]。

1.3 基本培養(yǎng)基選擇

目前，三七組織培養(yǎng)中，用于愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基主要是MS培養(yǎng)基[1-4]。也有少數(shù)研究使用 6，7V[5]。

1.4 培養(yǎng)條件

三七愈傷組織誘導(dǎo)一般是在黑暗條件下進(jìn)行，光照有一定抑制作用[4-6]，溫度和pH值一般分別為25 ℃和 5.8[1，5，7]。

2 次生代謝物生產(chǎn)

三七與其下游產(chǎn)品的藥效成分主要集中在皂苷，通過組織培養(yǎng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)皂苷規(guī)?；a(chǎn)。用植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)已成為當(dāng)代生物制藥的一個(gè)重要領(lǐng)域；通過誘導(dǎo)愈傷組織、篩選培養(yǎng)條件、選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系和添加合適誘導(dǎo)物質(zhì)等方法，可以進(jìn)行細(xì)胞原的批量生產(chǎn)，然后分離提取得到代謝產(chǎn)物。這種生產(chǎn)方式得到的次生化合物含量往往比植物體高出2～5倍，而且細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)具有不受各種外界環(huán)境的影響、繁殖速度快、培養(yǎng)規(guī)模大和提供大量均勻一致植物培養(yǎng)物等優(yōu)點(diǎn)，適于大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。

日本、韓國通過細(xì)胞培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)已實(shí)現(xiàn)了人參皂苷的工廠化生產(chǎn)。而三七在這方面的研究起步較晚，鄭光植等[1，4，6]進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，對外植體類型、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、外源激素、培養(yǎng)基天然補(bǔ)充物等影響因子進(jìn)行了研究，使三七愈傷組織的生長速率達(dá)220 mg·L-1·D-1，愈傷組織中總皂苷含量達(dá)13%。侯篙生等[8]用5 L氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外循環(huán)反應(yīng)器中三七總皂苷含量達(dá)9.48%；內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器中三七多糖含量達(dá)24%，但三七細(xì)胞生長比較緩慢。周立剛等[9]（1992）用10 L的攪拌式發(fā)酵罐對三七細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，皂苷含量為干重的11.21%，皂苷產(chǎn)率為1513.3 mg·L-1，細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)率為每月13.58 g干重·L-1，均比懸浮培養(yǎng)高。甘煩遠(yuǎn)等[10]研究了人參寡糖素對三七懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)人參寡糖素對三七懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長具有明顯的促進(jìn)作用。

3 不定根與不定芽誘導(dǎo)

根據(jù)研究目的的不同，可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素的種類和濃度，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定根或者不定芽。如果是為了生產(chǎn)次生代謝物，則誘導(dǎo)不定根，進(jìn)而對不定根進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，擴(kuò)增出大量不定根后從中提取皂苷等次生代謝物；如果是為了獲得組培苗，則誘導(dǎo)不定芽，繼而誘導(dǎo)生根，從而形成完整的組培苗用于栽培或其它研究。

3.1 不定根誘導(dǎo)

人參不定根培養(yǎng)已成功實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，反應(yīng)器規(guī)模達(dá)到10000 kg[11]，而三七在這方面處于起步階段。高先富等[2]研究表明：幼嫩花蕾愈傷組織是誘導(dǎo)不定根的理想材料；IBA誘導(dǎo)不定根的能力最強(qiáng)；采用將不定根連其母體組織一起在液體培養(yǎng)系統(tǒng)中連續(xù)培養(yǎng)后再分離的方法較好。淡墨[12]研究了茉莉酸甲酯對三七不定根次生代謝產(chǎn)物的影響，表明茉莉酸甲酯刺激后三七不定根的次生代謝產(chǎn)物與天然三七根更為相似，證明茉莉酸甲酯可以作為三七不定根增加活性次生代謝產(chǎn)物合成的有價(jià)值的誘導(dǎo)劑，值得進(jìn)一步研究。在建立了三七不定根培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，可用生物反應(yīng)器進(jìn)行放大培養(yǎng)，并優(yōu)化培養(yǎng)條件，最終實(shí)現(xiàn)皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 不定芽誘導(dǎo)與組培苗

劉瑞駒等[13]首次報(bào)道了三七胚狀體的發(fā)生，并成功誘導(dǎo)出不定芽進(jìn)而形成完整植株。陳偉榮等[7]對三七試管苗進(jìn)行了詳細(xì)的研究，獲得了大量組培苗。許鴻源等[14-15]使用靈發(fā)素誘導(dǎo)莖愈傷組織產(chǎn)生胚狀體取得了較好效果，胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)90%左右，且約有30%以上的胚狀體能發(fā)育成健壯的全苗，用三七葉片作為外植體也取得了與此相當(dāng)?shù)男ЧＳ纱丝梢姡和ㄟ^誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生胚狀體進(jìn)而分化不定芽可得到三七組培苗，但畸形胚和不完整胚較多、成苗率低。如何獲得更多正常的胚狀體、提高成苗率是需要繼續(xù)研究的內(nèi)容。

4 討論

在三七組織培養(yǎng)領(lǐng)域，由于起步較晚，各項(xiàng)技術(shù)還不是很成熟，要得到高皂苷含量和快速生長的愈傷組織，并將其用于細(xì)胞培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)皂苷生產(chǎn)的工業(yè)化，還需要深入研究。如何提高組培苗的成苗率，實(shí)現(xiàn)三七種苗的離體快繁也具有重要的研究價(jià)值，產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益。毛狀根具有可以在無激素的培養(yǎng)基上快速生長、擁有親本植物的次生代謝途徑、遺傳穩(wěn)定、生長迅速等特點(diǎn)，人參、西洋參毛狀根培養(yǎng)技術(shù)已比較成熟[16-17]，而三七還未開展毛狀根培養(yǎng)的研究，篩選適宜的發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)三七產(chǎn)生毛狀根可能是以后研究的熱點(diǎn)。

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