DC－CIK 細(xì)胞治療小兒惡性腫瘤研究現(xiàn)狀

王亞峰 綜述 劉秋玲 審校

小兒惡性腫瘤無(wú)論在臨床表現(xiàn)、組織病理類型還是治療反應(yīng)上均與成人惡性腫瘤不同，有其獨(dú)特的生物學(xué)特性，如小兒癌腫潛伏期短，生長(zhǎng)迅速，侵襲性強(qiáng)，多與環(huán)境的致癌因素?zé)o關(guān)，組織學(xué)上以母細(xì)胞瘤多見(jiàn)等［1］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入及綜合治療方法的不斷完善，腫瘤的診治水平得到了很大提高［2］。目前，除了手術(shù)、化療及放療外，細(xì)胞免疫治療已成為小兒腫瘤治療的第4 種重要手段。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是功能強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，可高效介導(dǎo)對(duì)特異性抗原的特異性免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine－induced killer cells，CIK)是一種新型高效的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有增殖速度快、殺傷活性高等優(yōu)點(diǎn)。樹(shù)突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC－CIK)共同培養(yǎng)后，具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和自然殺傷細(xì)胞的非組織相容性復(fù)合物限制性殺傷特性［3］，擁有強(qiáng)大的增殖活性和細(xì)胞毒活性。作為新一代過(guò)繼免疫細(xì)胞，DC－CIK 細(xì)胞目前已被用于多種成人腫瘤的治療，在部分小兒惡性腫瘤的治療中，DC－CIK 細(xì)胞也顯示出其獨(dú)特的療效。筆者就DC－CIK 細(xì)胞在小兒惡性腫瘤治療中的應(yīng)用情況作一綜述。

1 DC 細(xì)胞的生物學(xué)特性與抗腫瘤機(jī)制

1.1 DC 的生物學(xué)特性 1973 年Steinman 和Cohn 首次發(fā)現(xiàn)DC，因其表面的指狀突起而稱其為樹(shù)突狀細(xì)胞。DC 已被證明是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，其抗原遞呈能力較B 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞強(qiáng)數(shù)百倍甚至上千倍［4］。DC可通過(guò)下列4 種方式調(diào)控、維持機(jī)體免疫反應(yīng):(1)激活靜息型T 細(xì)胞誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，是機(jī)體免疫反應(yīng)的啟動(dòng)者和參與者;(2)直接或間接影響B(tài) 淋巴細(xì)胞的增殖、活化，參與體液免疫應(yīng)答;(3)與記憶T 細(xì)胞相互作用，誘發(fā)再次免疫應(yīng)答;(4)與自然殺傷細(xì)胞作用，促進(jìn)機(jī)體建立非特異性、天然免疫應(yīng)答等［5，6］。DC 廣泛分布于除腦以外的全身各臟器，能攝取加工抗原表達(dá)高水平MHC 分子、共刺激分子、黏附分子，并分泌高水平Th1 型細(xì)胞因子IL－12，故具有很強(qiáng)的抗原提呈能力，可有效激發(fā)T 細(xì)胞應(yīng)答。人DC 的主要特征性標(biāo)志為CDla、CD83 及CD11c。DC還表達(dá)MHCⅡ類分子，輔助刺激分子CD80 及CD86，黏附分子CD40、CD44、CD54 以及β1、β2 整合素家族成員。此外，DC 還能分泌IL－1、IL－6、IL－8、IL－12、TNF－α、IFN－α等細(xì)胞因子，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。

1.2 DC 的抗腫瘤機(jī)制 大量研究發(fā)現(xiàn)，DC 的抗腫瘤機(jī)制主要有［7］:(1)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量效應(yīng)T 細(xì)胞。在腫瘤患者體內(nèi)，只有抗原提呈細(xì)胞捕獲并加工處理呈遞腫瘤抗原后，才能形成針對(duì)腫瘤抗原的特異性T 細(xì)胞克隆，從而形成有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)。針對(duì)腫瘤患者體內(nèi)的免疫狀況，DC 可在抗腫瘤治療中表現(xiàn)出其突出的優(yōu)勢(shì)，如通過(guò)細(xì)胞表面高水平的MHC－I、MHC－Ⅱ類分子呈遞豐富的腫瘤抗原肽作為激活抗腫瘤細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的第一信號(hào)，同時(shí)提供高水平的B7－1、B7－2、CD40 等黏附分子作為第二信號(hào)而充分激活腫瘤特異性的CTL。(2)啟動(dòng)效應(yīng)T 細(xì)胞遷移至腫瘤部位。DC 有別于其他抗原提呈細(xì)胞的突出特性之一是其具有較強(qiáng)的定向遷徙能力。有報(bào)道表明，DC 能通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子選擇性趨化T 細(xì)胞，通過(guò)血管內(nèi)皮屏障而增加腫瘤部位的效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)量。(3)保持效應(yīng)T 細(xì)胞在腫瘤部位的長(zhǎng)期存在。DC 和T 細(xì)胞之間的相互作用，以及濾泡DC 對(duì)抗原的保留都可促使DC分泌某些生存因子而促進(jìn)T 細(xì)胞的生長(zhǎng)，維持T 細(xì)胞反應(yīng)。(4)抑制腫瘤血管的生成。DC 可能通過(guò)釋放某些抗血管生成物質(zhì)IFN－γ、IL－12 及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。(5)DC 與T 細(xì)胞結(jié)合后，可以分泌大量IL－12 及IL－ 8 等細(xì)胞因子，主導(dǎo)CD4+Thl 型的免疫應(yīng)答，有利于對(duì)腫瘤病灶的清除。

2 CIK 細(xì)胞的生物學(xué)活性與抗腫瘤機(jī)制

2.1 CIK 細(xì)胞的生物活性 CIK 細(xì)胞最初是指在健康人體外周血中的CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞，占1% ～5%。Schmidt－wolf 等［8］于1991 年首次發(fā)現(xiàn)在外周血淋巴細(xì)胞中加入IFN－γ、IL－2 和抗CD3 單克隆抗體，可培養(yǎng)出大量CD3+和CD56+T 細(xì)胞，兼具有T 淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性和NK 細(xì)胞的非MHC 限制性殺瘤活性，具有增殖速度快，殺傷活性高，抗瘤譜廣等特性。通過(guò)對(duì)CIK 細(xì)胞的表面標(biāo)志研究發(fā)現(xiàn)，CIK 細(xì)胞為CD3+CD56+細(xì)胞群，而這些CD3+CD56+CIK 細(xì)胞主要來(lái)源于CD3+CD56+的T 淋巴細(xì)胞，而非CD3+CD56+的NK 細(xì)胞。CIK 細(xì)胞的另一重要來(lái)源是CD4+CD8+T 淋巴細(xì)胞群。由于CD4+CD8+T 細(xì)胞經(jīng)過(guò)1 個(gè)月的細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)后，有56%的T 細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)CD3+CD56+，說(shuō)明CD4+CD8+T 細(xì)胞也是CIK 細(xì)胞的重要來(lái)源。這種雙陽(yáng)性T 細(xì)胞按細(xì)胞受體的不同，進(jìn)一步可分為CD3+CD56+αβT 細(xì)胞及CD3+CD56+γδT 細(xì)胞兩種亞群［9，10］。

2.2 CIK 細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制 目前關(guān)于CIK 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷原理尚未完全闡明，研究表明，其可能的機(jī)制有以下幾點(diǎn):(1)CIK 細(xì)胞能通過(guò)黏附因子識(shí)別腫瘤細(xì)胞，通過(guò)兩條途徑直接殺傷靶細(xì)胞:一是CIK 細(xì)胞通過(guò)淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原－1/細(xì)胞間黏附分子－1(LFA－1/ICAM－1)系統(tǒng)與靶細(xì)胞通過(guò)釋放顆粒酶和穿孔素對(duì)靶細(xì)胞實(shí)行MHC 非限制性殺傷。另一途徑為CIK 細(xì)胞表面的CD3 樣受體被結(jié)合而激活CIK 細(xì)胞產(chǎn)生胞漿毒性顆粒介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用［11］。(2)CIK 細(xì)胞活化后可分泌IL－2、TNF－α、IFN－γ、GM－CSF 等多種抗腫瘤細(xì)胞因子，提高了細(xì)胞毒作用，或調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)CIK 細(xì)胞的敏感性，發(fā)揮直接抑制作用和免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的間接殺傷作用［12］。(3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死。CIK 細(xì)胞能活化腫瘤細(xì)胞凋亡基因，使得FLIP、Bcl－2、Bcl－xL、DAD1 和survivin 基因表達(dá)上調(diào)［13］。Cooper 等［14］的研究顯示，培養(yǎng)的CIK 細(xì)胞表面表達(dá)的Fas－L (fas 配體)與相應(yīng)腫瘤細(xì)胞識(shí)別結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)源性DNA 內(nèi)切酶，從而起到殺瘤作用。(4)CIK 細(xì)胞回輸后可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體的免疫功能。

3 CIK 與DC 的協(xié)同抗腫瘤作用

臨床研究發(fā)現(xiàn)部分患者進(jìn)行CIK 細(xì)胞治療時(shí)療效不太理想，原因可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)這些免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生了抵抗，可能與腫瘤患者功能性的DC 缺乏有關(guān)［15］。因此，將CIK 細(xì)胞與DC 聯(lián)合治療惡性腫瘤，將有助于解除部分腫瘤患者T 細(xì)胞的免疫無(wú)能，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。研究表明，DC 和CIK 共同培養(yǎng)后具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，體外擴(kuò)增速度更快，殺瘤譜更廣［16］。DC 和CIK 是腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分，前者識(shí)別抗原、激活獲得性免疫系統(tǒng)，后者通過(guò)發(fā)揮自身細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，二者聯(lián)合確保了一個(gè)高效和諧的免疫體系［17］。目前，關(guān)于DC－CIK 殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制尚不十分清楚，除上述的CIK 細(xì)胞抗腫瘤機(jī)制外，劉苗等［18，19］實(shí)驗(yàn)證實(shí)還可能與Foxp3 和GATA－3 基因參與了T－bet 介導(dǎo)的DC－CIK 細(xì)胞殺瘤途徑有關(guān)，其殺瘤機(jī)制主要表現(xiàn)為Th1 途徑活化，而Th2 途徑和Treg 途徑受抑制。

4 DC－CIK 細(xì)胞在小兒惡性腫瘤中的應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 DC－CIK 細(xì)胞在兒童白血病治療中的應(yīng)用 目前，已有少數(shù)學(xué)者運(yùn)用DC－CIK 細(xì)胞治療小兒白血病。文欽等［20］對(duì)1 例難治復(fù)發(fā)性髓細(xì)胞白血病患兒行DC－CIK 細(xì)胞治療，DC－CIK 細(xì)胞共輸注5 次，患兒均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。定期復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、巨細(xì)胞病毒指標(biāo)，均在正常范圍內(nèi)，細(xì)胞治療107 d 后復(fù)查骨髓示完全緩解。Liu 等［21］從白血病患兒骨髓中獲得單個(gè)核細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)成DC－CIK 細(xì)胞。在培養(yǎng)10 ～25 d 后，將DC－CIK 與白血病細(xì)胞混合培養(yǎng)并用MTT 法檢測(cè)其殺瘤活性。結(jié)果顯示:在效靶比為12.5∶1或25∶1 時(shí)，殺瘤率可達(dá)50% ～60%，提示DC－CIK 細(xì)胞對(duì)兒童白血病細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷作用。這些研究結(jié)果將推進(jìn)臨床DC－CIK 細(xì)胞治療兒童白血病的發(fā)展，尤其是對(duì)難治復(fù)發(fā)性白血病提供新的治療方法。

4.2 DC－CIK 細(xì)胞在兒童惡性淋巴瘤治療中的應(yīng)用 惡性淋巴瘤在成人中多見(jiàn)，兒童惡性淋巴瘤的發(fā)病率較成人低，以非霍奇金淋巴瘤為主，預(yù)后較差。在成人惡性淋巴瘤臨床治療應(yīng)用中DC－CIK 細(xì)胞療法已取得顯著效果［22－24］，在兒童淋巴瘤的臨床治療中尚未見(jiàn)資料報(bào)道，但已有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)的的實(shí)驗(yàn)室研究。Wei 等［25］從健康志愿者外周血中培養(yǎng)出DC－CIK 細(xì)胞，將其培養(yǎng)9 d 后與Raji 淋巴瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)，在一定效靶比下觀察DC－CIK 細(xì)胞對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的殺傷率。結(jié)果顯示:在效靶比為40 ∶1 時(shí)殺傷率最高，達(dá)(67.18 ±4.01)%，而且殺傷率與效靶比在5∶1 至40∶1 之間呈正相關(guān)。袁利亞等［26］取昆明小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞在體外誘導(dǎo)DC－CIK 細(xì)胞，再將小鼠EL4 淋巴瘤Pcc4 胚癌細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，培養(yǎng)一段時(shí)間后與DC－CIK 細(xì)胞混合培養(yǎng)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫表型，MTT 法測(cè)定殺傷活性。結(jié)果顯示:DC－CIK 細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD3+和CD3+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，在(5∶1)～(40∶1)的效靶比范圍內(nèi)，DC－CIK細(xì)胞對(duì)淋巴瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷率。

4.3 DC－CIK 細(xì)胞在兒童惡性肉瘤治療中的應(yīng)用 兒童惡性肉瘤(如橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤等)發(fā)病率較低，臨床治療主要以化療、手術(shù)加局部放療為主。細(xì)胞免疫療法可能會(huì)具有顯著的治療效果，但目前尚處在實(shí)驗(yàn)研究階段。Kucis等［27］從6 名健康志愿者外周血中提取單個(gè)核細(xì)胞，然后培養(yǎng)成CIK 細(xì)胞，再將CIK 細(xì)胞分別和橫紋肌肉瘤細(xì)胞株RMS13、Rh30、RH41 等在一定條件下混合培養(yǎng)。對(duì)CIK 表型分子、增殖速度、殺瘤率等多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn):CIK 細(xì)胞與橫紋肌肉瘤細(xì)胞株混合培養(yǎng)后，約有50%的橫紋肌肉瘤細(xì)胞被殺死，其中NKG2D 可能在殺瘤過(guò)程中起了重要作用。Michael 等［28］對(duì)尤文肉瘤細(xì)胞株進(jìn)行熒光染色，傳代培養(yǎng)后建立裸鼠模型。將含有CD3xHer2/neu 雙抗體的CIK 細(xì)胞注射裸鼠并觀察腫瘤生長(zhǎng)變化。結(jié)果顯示:含有CD3xHer2/neu 雙抗體的CIK 細(xì)胞有強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。上述研究的CIK 細(xì)胞缺少DC 的激活，殺瘤活性有待進(jìn)一步增強(qiáng)。

4.4 DC－CIK 細(xì)胞在兒童視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤治療中的應(yīng)用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是兒童常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，目前主要以手術(shù)、化療、放療及局部治療進(jìn)行綜合治療，細(xì)胞免疫治療因其獨(dú)特的優(yōu)越性有可能成為治療RB 新的重要手段。唐松等［29］從RB 外周血中誘導(dǎo)擴(kuò)增出成熟DC，并進(jìn)一步利用RB 腫瘤抗原沖擊致敏DC，激活自體T 淋巴細(xì)胞，通過(guò)不同的效靶比體外對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SO－RB50 進(jìn)行殺傷。結(jié)果表明，DC 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞對(duì)SO－ RB50 有較強(qiáng)的殺傷作用，顯示出細(xì)胞免疫療法在治療RB 上有潛在的臨床價(jià)值，但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道DC－CIK 細(xì)胞治療RB 的資料。

4.5 DC－CIK 細(xì)胞在兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療中的應(yīng)用 兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的顱外神經(jīng)源性實(shí)體瘤，惡性程度高，進(jìn)展較快，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移［30］，傳統(tǒng)治療方法療效不理想。有研究表明:細(xì)胞因子誘導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤有一定的殺傷作用。Richard 等［31］把神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞注入28 只小鼠體內(nèi)，待腫瘤生長(zhǎng)一段時(shí)間后，再向小鼠體內(nèi)注射IL－2 和IL－18 誘導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞。結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組中有57%小鼠的瘤細(xì)胞完全消失。關(guān)于DC－CIK 細(xì)胞治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

5 問(wèn)題與展望

目前，DC－CIK 細(xì)胞在成人腫瘤的臨床治療已經(jīng)開(kāi)展，但開(kāi)展時(shí)間較短，數(shù)據(jù)也不豐富，需繼續(xù)擴(kuò)大DC－CIK 細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用范圍，以獲取更多的臨床資料。小兒惡性腫瘤在腫瘤的發(fā)生和生物學(xué)特性方面與成人腫瘤有很大區(qū)別，且小兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，免疫功能低下，耐受性差，所以DC－CIK 細(xì)胞免疫療法除在小兒血液系統(tǒng)惡性腫瘤中有少數(shù)臨床應(yīng)用外，在其他小兒惡性腫瘤中均停留在實(shí)驗(yàn)研究階段，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)臨床試驗(yàn)的資料報(bào)道。另外，DC－CIK的治療方案和療效標(biāo)準(zhǔn)尚待進(jìn)一步統(tǒng)一和規(guī)范。細(xì)胞治療注射途徑、不良反應(yīng)和注射時(shí)間等需要進(jìn)一步探討，尤其是不良反應(yīng)，雖然不似化療藥物那樣具有明顯的細(xì)胞毒作用，但其培養(yǎng)體系中不少成分也能引起一定不良反應(yīng)，如IL－2、IFN－γ 可引起寒戰(zhàn)、發(fā)熱、肌痛及胃腸道反應(yīng)等，需引起臨床足夠的重視。隨著相關(guān)研究的不斷深入，DC－CIK 過(guò)繼免疫細(xì)胞療法在聯(lián)合放療、化療及手術(shù)治療中的價(jià)值以及在腫瘤綜合治療中的地位將會(huì)得到進(jìn)一步證實(shí)和肯定，從而進(jìn)一步提高臨床療效，最大程度地改善腫瘤患者的生活質(zhì)量。

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