疏肝健脾方對(duì)NASH大鼠肝組織IKKβ mRNA和蛋白表達(dá)的影響*

魏 波， 楊欽河△， 王文晶， 胡巢鳳， 方梅霞， 刑會(huì)杰，張玉佩， 程少冰， 王彥平， 馮高飛， 何秀敏， 徐擁建， 閆海震， 黃 進(jìn)

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1中醫(yī)系，2病理生理學(xué)教研室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，廣東廣州510632)

核因子κB(nuclear factor κB，NF－κB)抑制蛋白激酶(inhibitor κB kinase，IKK)復(fù)合體是NF－κB信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)物，IKKβ是IKK復(fù)合體中的一個(gè)催化亞基，通過(guò)經(jīng)典途徑激活NF－κB，參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等一系列病理生理過(guò)程［1］，實(shí)驗(yàn)證明IKKβ在NF－κB信號(hào)通路活化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［2－3］。有研究表明，在非酒精性脂肪性肝炎(non－alcoholic steatohepatitis，NASH)動(dòng)物模型和NASH患者中，肝臟NF－κB的表達(dá)水平均有顯著升高［4－5］，NF－κB的激活可能是肝臟和全身胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的根源，參與NASH的發(fā)病，因此，抑制NF－κB蛋白和mRNA的表達(dá)，可能成為有效防治NASH的途徑之一。鑒于NF－κB在NASH發(fā)病中的重要作用，而IKKβ又是NF－κB炎癥信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)物，所以進(jìn)一步深入探討IKKβ在NASH發(fā)病中的作用具有十分重要的意義。我們的前期的研究［5－9］表明，疏肝健脾方有較好抗非酒精性脂肪性肝病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的作用，但是在NASH階段是如何發(fā)揮藥理作用的還不清楚，所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察大鼠血清炎癥細(xì)胞因子及肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白在疏肝健脾方干預(yù)后的變化，探討疏肝健脾方抗NASH的分子機(jī)制，為NASH的中醫(yī)藥防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量(200 ±20)g，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(粵)2008－0020;粵監(jiān)證字為2008A020。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 (1)疏肝方(柴胡疏肝散)組成:柴胡6 g、川芎5 g、枳殼5 g、陳皮6 g、白芍5 g、香附5 g和炙甘草3 g;(2)健脾方(參苓白術(shù)散)組成:人參15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、薏苡仁9 g、砂仁6 g、山藥15 g、桔梗6 g、白扁豆12 g、蓮子9 g和炙甘草9 g; (3)綜合方，即:柴胡疏肝散與參苓白術(shù)散的合方。

上述藥物均為深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司中藥配方顆粒劑，購(gòu)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。疏肝方及健脾方組成、劑量均參考《方劑學(xué)》教材［10］。各組低劑量組藥量為人臨床等效劑量，高劑量組藥量為人臨床等效劑量的3倍用量。

1.3 主要試劑 Quant cDNA第1鏈合成試劑盒和SYBR Green熒光定量 PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor－alpha，TNF－α)測(cè)定ELISA試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;白細(xì)胞介素6(interleukin－6，IL－6)測(cè)定ELISA試劑盒和IL－1測(cè)定ELISA試劑盒購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司;內(nèi)參照GAPDH蛋白抗體、IKKβ蛋白抗體及其磷酸化蛋白抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為:正常對(duì)照組(灌服蒸餾水)、模型組(灌服蒸餾水)、疏肝方高劑量組(灌服9.6 g·kg－1·d－1劑量的柴胡疏肝散)、疏肝方低劑量組(灌服3.2 g·kg－1·d－1劑量的柴胡疏肝散)、健脾方高劑量組(灌服30.0 g·kg－1·d－1劑量的參苓白術(shù)散)、健脾方低劑量組(灌服10.0 g· kg－1·d－1劑量的參苓白術(shù)散)、綜合方高劑量組(灌服39.6 g·kg－1·d－1劑量的柴胡疏肝散和參苓白術(shù)散合方)和綜合方低劑量組(灌服13.2 g·kg－1· d－1劑量的柴胡疏肝散和參苓白術(shù)散合方)，每組均9只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，均自由進(jìn)食和飲水。

2.2 大鼠NASH模型建立 大鼠NASH實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒄瘴覀円酝姆椒ǎ?－7］，并加以改進(jìn)。正常對(duì)照組大鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其它各組均以高脂飼料(基礎(chǔ)飼料88%、豬油10%、膽固醇1.5%、膽鹽0.5%)喂養(yǎng)，在施以造模因素的同時(shí)，按照10 mL/kg分別灌胃給予正常組和模型組大鼠蒸餾水，各藥物組大鼠相應(yīng)的藥物劑量按大鼠體表面積折算，每天早晚各1次。每天上午定時(shí)更換大鼠高溫消毒飲用水和添加飼料。各組動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)于(24±2)℃室溫、明暗各12 h的暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每周定時(shí)稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量，連續(xù)16周。

2.3 標(biāo)本采集及樣本制備 各組動(dòng)物均于末次給藥后，禁食不禁水12 h，所有大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(1 mL/kg)，腹主動(dòng)脈采血，取血后迅速摘取肝臟，距離肝邊緣0.5 cm處取相同部位肝右葉組織，用于相關(guān)檢測(cè)(注:因灌胃不當(dāng)，正常組、健脾高、低劑量組大鼠各死亡1只)。

2.3.1 病理染色 取距離肝右緣約0.5 cm處相同部位肝組織小塊，大小約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，經(jīng)10%中性甲醛溶液固定標(biāo)本，常規(guī)脫水、石蠟包埋，作3 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理學(xué)改變。

2.3.2 血脂及肝脂檢測(cè) 腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置30 min，4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high－density lipoprotein cholesterol，HDL－C)和低密度脂蛋白膽固醇(low－density lipoprotein cholesterol，LDL－C)的含量;取肝組織100 mg加入0.9 mL異丙醇中，勻漿，于4℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝組織勻漿TC、TG的含量。

2.3.3 血清炎癥細(xì)胞因子測(cè)定 從每組中隨機(jī)抽取8只大鼠，將其由腹主動(dòng)脈取血5 mL注入試管中，搖勻后4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于－80℃保存待測(cè)，用ELISA法檢測(cè)TNF－α、IL－6和IL－1的濃度，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2.3.4 肝組織IKKβ mRNA測(cè)定 取肝組織約50 mg用Trizol法抽提總RNA，用核酸微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度及濃度，要求A260/A280在1.8～2.0，根據(jù)所測(cè)RNA的濃度值，將每管RNA的濃度調(diào)至2 g/L準(zhǔn)備下一步反轉(zhuǎn)錄;采用Quant cDNA第1鏈合成試劑盒依照說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);以GAPDH為內(nèi)參照，采用實(shí)時(shí)熒光定量 RT－PCR進(jìn)行IKKβ和GAPDH產(chǎn)物擴(kuò)增及結(jié)果分析。登陸Gen-Bank獲得IKKβ(NM_053355.2)和GAPDH(NM_ 017008.3)的cDNA序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，IKKβ上游引物5’－CCGTGACTGTTGACTACTG －3’，下游引物 5’－GTCCACTTCGCTCTTCTG－3’;GAPDH上游引物5’－CAAGTTCAACGGCACAGTCAA－3’，下游引物5’－TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC－3’。反應(yīng)體系:2.5×Real－time Master Mix/20×SYBR solution 9 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)至總體積20μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，GAPDH 57.5℃、IKKβ 52℃ 退火20 s，68℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后再于72～95℃，持續(xù)5～10 s繪制熔解曲線。反應(yīng)完畢，采用Opticon Monitor 3.1軟件分析結(jié)果，用公式2－ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量。Ct值=每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=(Ct目的基因－ Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組－ (Ct目的基因－Ct內(nèi)參其因)空白組，以未處理的空白組基因表達(dá)水平為1，2－ΔΔCt為實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于空白組的變化倍數(shù)。

2.3.5 肝組織IKKβ磷酸化蛋白測(cè)定 取肝組織約50 mg，在冰凍緩沖液中研碎，加入去污劑蛋白裂解液(含苯甲基磺酰氟)400 μL進(jìn)行總蛋白的提取，用碧云天BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定樣本蛋白的濃度，計(jì)算取含蛋白40 μg的溶液體積為上樣量，加入樣品處理液，煮沸7～10 min，SDS－PAGE電泳120 min轉(zhuǎn)至PVDF膜后，室溫下用5%脫脂奶粉(脫脂奶粉+TBST)封閉1.5 h;洗膜后加I抗，室溫孵育2 h(或4℃過(guò)夜)，TBST漂洗3次，每次10 min;加II抗，室溫孵育1.5 h，TBST漂洗3次，每次5 min。將碧云天化學(xué)發(fā)光液A液和B液約1 mL充分混勻后鋪于膜正面，室溫1～3 min后，去除膜表面的殘液，置于曝光盒中曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件掃描各條帶的吸光度(A值)并分析結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多樣本組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠肝組織病理變化

光鏡下正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝索整齊，肝細(xì)胞呈多邊形，邊界清，胞內(nèi)無(wú)脂滴沉積。模型組大鼠肝組織脂肪變性明顯，可見(jiàn)肝索紊亂，肝小葉內(nèi)、匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)脂滴大小不一，以大泡性脂肪滴為主，胞核被擠向邊緣，難以找到正常的肝細(xì)胞。上述改變提示NASH造模成功，呈中重度脂肪變，病理模型成功。各藥物干預(yù)組大鼠肝組織可見(jiàn)脂滴空泡均有不同程度減少，肝小葉、匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況均較模型組有不同程度的改善，其中以綜合方高劑量組改善最為明顯，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Pathological changes of rat hepatic tissues from each group(HE staining，×200).圖1 各組大鼠肝組織病理變化

2 各組大鼠血脂及肝脂的變化

與正常組相比，模型組大鼠血清中TC、LDL－C及肝組織TC、TG均有顯著升高(P＜0.01)，血清TG有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與模型組相比，各藥物干預(yù)組大鼠的血脂均有不同程度的下降，其中血清TG以綜合方高、低劑量組及健脾方高劑量組下降較為明顯(P＜0.01，P＜0.05)，肝組織TG含量以綜合方高、低劑量組、健脾方高劑量組及疏肝方高劑量組下降顯著(P＜0.01，P＜0.05)，肝組織TC含量以綜合方高劑量組下降明顯(P＜0.01)，見(jiàn)表1、2。

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL－C和LDL－C含量的比較Table 1 .The serum levels of TC，TG，HDL－C and LDL－C in rats from each group(mmol/L.±s)

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL－C和LDL－C含量的比較Table 1 .The serum levels of TC，TG，HDL－C and LDL－C in rats from each group(mmol/L.±s)

＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group.

?

表2 各組大鼠肝組織TC和TG含量的比較Table 2 .The content of TC and TG in rat hepatic tissues from each group(mmol/L.±s)

表2 各組大鼠肝組織TC和TG含量的比較Table 2 .The content of TC and TG in rat hepatic tissues from each group(mmol/L.±s)

＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group.

?

3 各組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子的變化

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF－α、IL－1和IL－6含量均有明顯升高(P＜0.01，P＜0.05);與模型組相比，各藥物組大鼠血清TNF－α和IL－6含量有不同程度的下降，其中各藥物組的高劑量組均比相應(yīng)的低劑量組改變明顯，TNF－α含量以疏肝方高劑量組、健脾方高劑量組和綜合方高、低劑量組下降明顯(P＜0.01，P＜0.05);IL－1和IL－6含量均以綜合方高劑量降低顯著(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清TNF－α，IL－1和IL－6水平變化的比較Table 3 .The serum levels of TNF－α，IL－1 and IL－6 in rats from each group(ng/L.±s.n=8)

表3 各組大鼠血清TNF－α，IL－1和IL－6水平變化的比較Table 3 .The serum levels of TNF－α，IL－1 and IL－6 in rats from each group(ng/L.±s.n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group.

?

4 各組大鼠肝組織IKKβ mRNA的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR結(jié)果顯示，以未做任何處理的正常組作為對(duì)照組，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織IKKβ mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，肝組織IKKβ mRNA的表達(dá)水平以綜合方高劑量組及健脾方高劑量組下降最為顯著(P＜0.05)，其余藥物干預(yù)組IKKβ mRNA的表達(dá)水平也有不同程度下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。

5 各組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達(dá)水平

Western bloting檢測(cè)結(jié)果顯示，各組大鼠肝組織內(nèi)均有IKKβ磷酸化蛋白的表達(dá)，長(zhǎng)期高脂飲食作用，IKKβ蛋白被顯著磷酸化，與正常組相比，模型組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，各藥物組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達(dá)水平均有不同程度下降，且各藥物組的高劑量組均比相應(yīng)的低劑量組下降明顯，IKKβ磷酸化蛋白的表達(dá)水平以健脾方高劑量組及綜合方高、低劑量組下降最為顯著(P＜0.01，P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

討論

NASH作為 NAFLD的一種病理分型，處于NAFLD疾病譜中的關(guān)鍵階段，是單純性脂肪肝向肝纖維化、肝硬化進(jìn)展的重要中間環(huán)節(jié)，而且有研究報(bào)道NASH相關(guān)的肝硬化是肝細(xì)胞癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［11－12］。NASH發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，由糖、脂代謝紊亂到炎癥細(xì)胞因子分泌增加，再到肝臟慢性亞臨床炎癥狀態(tài)的形成、內(nèi)皮細(xì)胞功能的失調(diào)，進(jìn)一步刺激大量炎癥細(xì)胞因子和過(guò)氧化物釋放，損傷肝細(xì)胞，破壞肝功能，這是脂肪性肝炎、肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的演變過(guò)程，致炎因子與抗炎因子失平衡觸發(fā)氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)作為重要機(jī)制參與其中。本實(shí)驗(yàn)在用高脂飲食成功建立NASH大鼠模型的基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠存在明顯血脂、肝脂代謝紊亂，血清炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IL－1和IL－6含量、肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平均較正常組明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，且IKKβ mRNA及磷酸化蛋白表達(dá)變化基本一致，提示高脂飲食可能在蛋白和基因兩個(gè)水平上調(diào)肝臟IKKβ的表達(dá)，這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果相一致［13－14］。進(jìn)一步提示了IKKβ可能在促進(jìn)NASH的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用和意義。

Figure 2.Expression of IKKβ mRNA in rat hepatic tissues from each group measured by real－time fluorescence quantitative RT－PCR.1:normal group;2:model group; 3:Shu－gan recipe high dose group;4:Shu－gan recipe low dose group;5:Jian－pi recipe high dose group;6:Jian－pi recipe low dose group;7:composite recipe high dose group;8:composite recipe low dose group.±s.n=8.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05 vs model group.圖2 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)各組大鼠肝組織IKKβ mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

Figure 3.Expression of p－IKKβ protein in rat hepatic tissues from each group.1:normal group;2:model group; 3:Shu－gan recipe high dose group;4:Shu－gan recipe low dose group;5:Jian－pi recipe high dose group;6:Jian－pi recipe low dose group;7:composite recipe high dose group;8:composite recipe low dose group.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05 vs model group.圖3 各組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達(dá)

研究表明IKKβ通過(guò)2種方式參與NASH的發(fā)病［15－16］:(1)IKKβ作為一種 Ser/Thu蛋白激酶，可使胰島素受體底物 1(insulin receptor substrate1，IRS1)特定位點(diǎn)的絲氨酸殘基磷酸化，減弱胰島素受體與IRS1的結(jié)合、阻止胰島素信號(hào)向下游磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)的傳遞，從而削弱胰島素刺激的葡萄糖攝取和糖原合成，使三磷酸腺苷儲(chǔ)備減低，導(dǎo)致IR的發(fā)生，IR是NASH發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，且貫穿NASH發(fā)病的始終; (2)IKKβ被氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)菌和病毒及其代謝產(chǎn)物等諸多因素激活后顯著磷酸化，p－IKKβ可活化IκB，使之降解與NF－κB解離，活化后NF－κB移位至核內(nèi)，促進(jìn)多種炎性因子及炎性相關(guān)物質(zhì)大量釋放和表達(dá)，如TNF－α、IL－1、IL－6、INF－β等。這些炎癥因子不僅可以直接誘導(dǎo)肝臟的炎癥損傷，也可以反饋加強(qiáng)IKKβ的活化。在炎癥反應(yīng)的復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，IKKβ/NF－κB信號(hào)途徑是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，IKKβ對(duì)IκB的磷酸化是NF－κB激活的一個(gè)關(guān)鍵步驟，有實(shí)驗(yàn)已證實(shí)IKKβ是促炎因子激活NF－κB所必需的IKK亞基［17］。IKKβ調(diào)節(jié)和控制著NF－κB活化，阻斷這一重要環(huán)節(jié)，減輕TNF－α、IL－1、IL－6等炎癥細(xì)胞因子對(duì)肝臟的損害，對(duì)于防治NASH及阻止肝纖維化、肝硬化病理進(jìn)程意義非常重大。

本研究結(jié)果顯示，疏肝健脾方可通過(guò)降低血清TG、LDL－C及肝組織TC、TG的含量而調(diào)節(jié)NASH大鼠脂質(zhì)代謝，改善肝組織病理?yè)p傷及炎癥浸潤(rùn)，與模型組相比，各藥物干預(yù)組大鼠血清TNF－α、IL－1和IL－6的含量、肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平均有不同程度降低，以綜合方高劑量組及健脾方高劑量組下降最為明顯(P＜0.01，P＜0.05)，且各藥物的高劑量組下降水平均優(yōu)于相應(yīng)的低劑量組。這提示疏肝健脾方可能是通過(guò)下調(diào)肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白的表達(dá)、抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌和合成，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，改善肝組織脂肪變性及炎癥狀態(tài)，從而發(fā)揮抗NASH的作用。IKKβ磷酸化蛋白可能是疏肝健脾方藥發(fā)揮藥理作用的重要靶點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明用疏肝健脾綜合方的高劑量和健脾方的高劑量收效更好，提示疾病由NAFLD進(jìn)展至NASH階段肝郁脾虛病機(jī)可能較為嚴(yán)重，并且在疾病的后期可能多以脾虛偏重為主，以方測(cè)證，我們可推斷肝郁脾虛且以脾虛為主可能是NASH階段的重要病機(jī)。肝郁脾虛的病機(jī)貫穿于NAFLD的發(fā)生發(fā)展自始至終，那么在這一過(guò)程中究竟是以肝郁為主，還是脾虛為主，或是肝郁脾虛并重，值得深入探討。同時(shí)各藥物的高劑量組優(yōu)于相應(yīng)的低劑量組，提示疏肝健脾方對(duì)NASH的干預(yù)存在一定的量效依賴關(guān)系，為以后的進(jìn)一步深入研究提供了重要依據(jù)。

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