專性厭氧菌發(fā)酵罐制氫工藝

陳璐圓 錢春香

(東南大學材料科學與工程學院，南京211189)

氫氣作為新一代綠色能源，具有清潔、高效、可再生等特點，若能夠產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，未來有望代替石油、天然氣等化石能源，從而減輕對環(huán)境的壓力［1］.氫能不是一次能源，需要從含氫的化合物中制取.目前全世界90%以上的氫來自化石燃燒，其余為水電解制氫，不論是哪種制氫方法都要直接或間接消耗大量的化石能源.生物制氫以其原料來源豐富、價格低廉等特點越來越受到人們的關注，是很有潛力的制氫方法之一［2］.

生物制氫包括光合生物制氫和厭氧發(fā)酵制氫2 種途徑.后者具有產(chǎn)率高、速率快且持續(xù)穩(wěn)定、反應裝置的設計操作簡單、原料來源廣泛且成本低等特點，更易于實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，因而成為生物制氫研究的主要方向［3］.厭氧發(fā)酵制氫菌種包括專性厭氧菌和兼性厭氧菌.其中，專性厭氧菌的培養(yǎng)、運輸及工業(yè)化條件苛刻，比兼性厭氧菌具有更廣泛的適應性和更高的產(chǎn)氫率［4］.然而，目前高效專性厭氧產(chǎn)氫菌種類較少，缺乏新型菌種，產(chǎn)氫效率偏低，并且制氫條件需進一步優(yōu)化.

本文以篩選得到的一種可用于發(fā)酵制氫的新型專性厭氧菌P 為研究對象，在批式發(fā)酵試驗的基礎上，以葡萄糖和糖蜜為碳源，分析了利用該種專性厭氧菌發(fā)酵罐制氫的方法，以期為生物制氫工業(yè)化應用提供一定的技術方法.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用由本實驗室選育出來的專性厭氧菌P，用液體培養(yǎng)基進行稀釋，培養(yǎng)時間為24 h.

液體培養(yǎng)基［5］組分包括:葡萄糖5.0～20.0 g，蛋白胨10.0～15.0 g，牛肉膏2.0～3.0 g，酵母提取物5.0～10.0 g，Na2HPO43.0～4.0 g，L-半胱氨酸0.2～0.5 g，L-半胱氨酸鹽0.2～0.5 g，質量分數(shù)為0.2%的刃天青指示劑1 mL，馬血清40～60 mL，蒸餾水1 L.

1.2 儀器及分析方法

生物發(fā)酵氣體產(chǎn)物中的氫氣和二氧化碳濃度使用GC9790A 型氣相色譜儀TCD 檢測器測定.相關儀器參數(shù)有:柱長2 m，柱箱溫度120 ℃，進樣溫度100 ℃，氬氣作載氣，流速為30 mL/min，進樣量為1 mL.使用標準氣體成分得到相應氣體的保留時間和峰面積，由此可計算得到待測的發(fā)酵氣體成分［6］.

根據(jù)3，5-二硝基水楊酸比色法，使用752 紫外分光光度計測定還原糖濃度，然后通過葡萄糖濃度標準曲線計算得到底物中未反應還原糖的含量［7-8］.

采用光密度法測量菌懸液濃度，即利用752 紫外分光光度計在波長為600 nm 時，以蒸餾水為空白對照管，測定細菌的菌濁度即OD600［9］.

發(fā)酵液相pH 值使用精密酸度儀來測定.

1.3 實驗方案

1.3.1 專性厭氧菌P 的生長倍增周期測定

首先以10%的接種量將菌液接種至200 mL培養(yǎng)基，然后調整培養(yǎng)基初始pH 值為7.0 后裝入250 mL 無色錐形瓶中密封，放入(37 ±1)℃培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)基OD600值.

1.3.2 以葡萄糖為底物的小樣試驗產(chǎn)氫能力測定

小樣實驗的產(chǎn)氫能力采用批式發(fā)酵工藝，試驗裝置如圖1所示.采用的碳源為葡萄糖［10］，培養(yǎng)基為200 mL，設置4 組試驗的葡萄糖濃度分別為5，10，15，20 g/L.純菌種接種量均為10%;將發(fā)酵液初始pH 值調至7.0，此后不再調控;整個吹掃、接種過程均需在高純氮氣存在的厭氧箱中進行，保證厭氧條件.將反應瓶放入恒溫汽浴振蕩培養(yǎng)箱中，轉速170 r/min，在(37 ±1)℃下培養(yǎng)24 h.

圖1 制氫裝置示意圖

1.3.3 發(fā)酵罐擴大試驗產(chǎn)氫能力測定

圖2 發(fā)酵罐實體圖

發(fā)酵罐產(chǎn)氫能力試驗同樣采用批式發(fā)酵工藝，發(fā)酵罐如圖2所示，發(fā)酵罐工藝流程圖如圖3所示.首先在小樣試驗基礎上，以所得最佳葡萄糖濃度及環(huán)境因子在發(fā)酵罐中擴大化產(chǎn)氫.然后研究糖蜜作為底物的產(chǎn)氫能力，糖蜜密度為1.34 g/mL，蔗糖質量分數(shù)為50%.設置5 組不同濃度下的產(chǎn)氫試驗，分別是20，30，35，40，50 g/L.純菌種接種量均為10%;將發(fā)酵液初始pH 值調至7.0，此后不再調控;其余操作同上.

圖3 發(fā)酵罐工藝流程圖

2 結果與討論

2.1 專性厭氧菌P 的生長規(guī)律

將菌濁度OD600=0.291 的菌液按照10%的比例接種至200 mL 培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)60 h，生長情況見圖4，其累積產(chǎn)氣曲線如圖5所示.

圖4 專性厭氧菌生長曲線

圖5 專性厭氧菌P 的累積產(chǎn)氣曲線

從圖4可看出，專性厭氧菌P 的生長周期可分為4 個時期:適應(停滯)期、對數(shù)期、生長穩(wěn)定期和死亡期.P 菌的停滯期較長，在靜置10 h 之后OD600值才逐漸靠近0.2，此時微生物才能發(fā)酵產(chǎn)氫，由圖5可看出，該階段產(chǎn)氣量幾乎為零;在10～20 h 階段，P 菌處于對數(shù)生長期，不僅細菌數(shù)量大量擴增，產(chǎn)氫能力也逐漸加強;20 h 后產(chǎn)氣量達到最大值.可以判定，專性厭氧菌P 在10 h 后加速生長，細菌數(shù)量迅速增多.

2.2 葡萄糖濃度對發(fā)酵氣體總產(chǎn)量的影響

無菌厭氧操作下，將培養(yǎng)的P 菌高濃度菌液與培養(yǎng)基按10%的比例接種于200 mL 的培養(yǎng)基中，底物濃度分別是5，10，15，20 g/L.然后將接種好的發(fā)酵液封閉并從厭氧箱中取出，于溫度為(37±1)℃、轉速為170 r/min 的搖床振蕩培養(yǎng)并連接氫氣收集裝置.在培養(yǎng)過程中，收集氣體并實時記錄氣體產(chǎn)量.

實驗結果表明P 菌產(chǎn)氣總持續(xù)時間約24 h.底物濃度對P 菌氣體總產(chǎn)量的影響見圖6.最大產(chǎn)氣量為480 mL，氫氣量為302 mL，氫氣體積分數(shù)為63%，適合于在發(fā)酵過程中應用.葡萄糖濃度高低對P 菌氣體總產(chǎn)量和細胞生長的影響非常顯著，當葡萄糖濃度為20 g/L 時，氣體總產(chǎn)量最少，僅為255 mL/L，此時P 菌的細胞干重也只有0.38 g.在葡萄糖濃度為10 g/L 時，氣體總產(chǎn)量達到最大值480 mL/L，細胞干重達到最大值0.73 g/L，但在低于或高于該濃度時，氣體總產(chǎn)量和細胞干重都呈現(xiàn)下降趨勢.

圖6 底物濃度對氣體總產(chǎn)量的影響

當葡萄糖底物濃度較低時，不能向P 菌提供充足的營養(yǎng)物質，從而使P 菌生長受到限制;而葡萄糖濃度較高時，P 菌對其不能完全充分地利用，殘留的葡萄糖在反應瓶里堆積，使發(fā)酵液的pH 值降低，從而抑制P 菌生長，使其產(chǎn)氫受到影響.

2.3 以葡萄糖為底物的發(fā)酵罐擴大化試驗對發(fā)酵氣體總產(chǎn)量的影響

準備滅菌后的厭氧菌培養(yǎng)基6 L，將菌液以10%比例接種于6 L 液體培養(yǎng)基，于37 ℃發(fā)酵罐中培養(yǎng)，保持與發(fā)酵小樣試驗的所有環(huán)境因子相同，初始底物(葡萄糖)濃度為10 g/L，初始發(fā)酵pH 值為7.0，得到的累積氣體產(chǎn)量如圖7所示.相同情況下，以10 g/L 葡萄糖作為發(fā)酵基，接種10%菌液，發(fā)酵80 h，溫度環(huán)境一致，產(chǎn)氫量如表1所示.

圖7 發(fā)酵罐累積產(chǎn)氣曲線

表1 P 菌在發(fā)酵罐和小樣中產(chǎn)氫性能參數(shù)

在固定的實驗條件下，將得到的發(fā)酵罐實驗結果與前期220 mL 規(guī)模的小樣實驗結果進行對比，其氣體產(chǎn)量、底物分解率及氫氣質量分數(shù)的比較結果如圖8所示.

圖8 小樣和發(fā)酵罐產(chǎn)氫參數(shù)對比

由圖8(a)可見，恒定pH 值為7.0 的發(fā)酵罐實驗具有最高的累積氣體和氫氣產(chǎn)量.pH 恒定為7.0 的發(fā)酵罐和小樣實驗均比未調控pH 情況下具有更高的產(chǎn)氫量.而2 組發(fā)酵罐實驗氫氣產(chǎn)量比同等控制參數(shù)下小樣氫氣產(chǎn)量高.未調控pH 條件下，發(fā)酵罐氫氣產(chǎn)量為1.240 L/L，略高于小樣氫氣產(chǎn)量;調控pH 恒定時，發(fā)酵罐氫氣產(chǎn)量為2.473 L/L，比小樣提高了5%.由圖8(b)中葡萄糖分解率對比可見，同樣條件下發(fā)酵罐實驗的葡萄糖分解率要低于小樣實驗的葡萄糖分解率，尤其在未調控pH 時，葡萄糖分解率差異更為明顯.未調控pH時，發(fā)酵罐葡萄糖分解率僅為78.2%，與小樣相差將近8%;調控pH 條件下，發(fā)酵罐葡萄糖分解率為95.2%，略低于小樣葡萄糖分解率.由圖8(c)中氫氣質量分數(shù)對比可見，氫氣的質量分數(shù)與葡萄糖分解率呈相反的變化，發(fā)酵罐實驗所得到的氣體組成中，氫氣的質量分數(shù)明顯增加，二氧化碳的質量分數(shù)降低.2 組發(fā)酵罐實驗氫氣的質量分數(shù)均達到60%以上，相比未調控pH 小樣實驗和調控pH 恒定的實驗，氫氣質量分數(shù)分別提高了1.73%和8.95%.

2.4 糖蜜基質濃度對產(chǎn)氫性能的影響

糖蜜是一種制糖工業(yè)廢料，作為發(fā)酵底物，不但能夠發(fā)酵產(chǎn)氫，而且有利于環(huán)保除廢.在發(fā)酵罐單批次試驗中，糖蜜的用量和添加時間都有可能對產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率造成影響.糖蜜為微生物提供發(fā)酵產(chǎn)氫的原料并且?guī)椭x生長，因此需要確定最佳糖蜜添加量，若底物濃度不足，會使微生物代謝緩慢、產(chǎn)氫率下降;底物濃度過高，會對微生物制氫產(chǎn)生抑制作用.當糖蜜濃度分別為20，30，35，40，50 g/L 時，按照10%比例接種P 菌至6 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)基，所得產(chǎn)氣量變化曲線如圖9所示.

圖9 不同糖蜜基質濃度對發(fā)酵產(chǎn)氣的影響

由圖9可知，隨著糖蜜加入量從20 g/L 增加到35 g/L 時，每組試驗產(chǎn)氣效率逐步提高，并且產(chǎn)氫啟動時間也由10 h 縮短到5 h 左右.而繼續(xù)增加糖蜜用量，產(chǎn)氫效率反而降低.當糖蜜加入量達到50 g/L 時產(chǎn)氣量顯著降低，甚至低于糖蜜濃度30 g/L時的產(chǎn)氣量，說明底物濃度過高確實對產(chǎn)氫菌有抑制作用.因此，確定培養(yǎng)基中糖蜜濃度為35 g/L時產(chǎn)氣效率最佳，降低和提高糖蜜用量都會使產(chǎn)氫量下降.

3 結論

1)專性厭氧菌P 可用于發(fā)酵底物為葡萄糖的發(fā)酵制氫過程，其發(fā)酵制氫的最佳工藝條件是發(fā)酵底物葡萄糖的濃度為10 g/L，發(fā)酵時pH 值恒定為7.0，接種比例為10%.在此條件下，發(fā)酵罐氣體總產(chǎn)量達到最大值.

2)恒定pH 值為7.0 的發(fā)酵罐實驗具有最高的累積氣體和氫氣產(chǎn)量.每升培養(yǎng)基可產(chǎn)氫氣2.473 L，比小樣提高了5%;葡萄糖分解率達到95.2%，氫氣的質量分數(shù)達到68.73%，相比未調控pH 實驗結果均有顯著提高.

3)選用糖蜜為底物發(fā)酵制氫有利于環(huán)保除廢，確定培養(yǎng)基中的糖蜜濃度為35 g/L 時產(chǎn)氣效率最佳.底物不足或者過量對微生物產(chǎn)氫的抑制作用較明顯，因此降低和提高糖蜜用量都會使產(chǎn)氫量下降.

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