鄭曉輝,巴特爾·巴克*,海利力·庫(kù)爾班,茹鮮·木沙,劉珊珊
(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院,烏魯木齊 830052)
植物體內(nèi)有許多酶參與生化反應(yīng),調(diào)節(jié)和控制著代謝的方向和速率。正常情況下,植物依賴(lài)體內(nèi)存在的活性氧清除系統(tǒng),包括SOD、POD和CAT等維持自由基生成與消除的動(dòng)態(tài)平衡,因此對(duì)活性氧清除的能力是決定細(xì)胞應(yīng)對(duì)脅迫抗性的關(guān)鍵因素。整個(gè)保護(hù)酶系統(tǒng)防御能力的強(qiáng)弱取決于這幾種酶相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。而植物體內(nèi)保護(hù)酶活性的強(qiáng)弱受到溫度變化的直接影響:凍害發(fā)生時(shí),細(xì)胞中原生質(zhì)過(guò)度脫水,蛋白質(zhì)變性,酶活性下降或喪失,冰晶體還會(huì)對(duì)細(xì)胞造成物理性損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡;日灼發(fā)生時(shí),由于溫度過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性或凝固,酶失去活性,組織脫水灼傷甚至死亡,外在表現(xiàn)為樹(shù)干干燥開(kāi)裂,葉片出現(xiàn)死斑。內(nèi)陸地區(qū)冬季樹(shù)干南側(cè)受日光直射,皮層內(nèi)溫度上升到20℃或更高,而北側(cè)皮層內(nèi)溫度與氣溫(0~5℃)大致相同,這種冷熱不均,使皮層與木質(zhì)部?jī)?nèi)脹外縮,皮層開(kāi)裂[1]。當(dāng)日灼和凍害同時(shí)發(fā)生時(shí),不僅會(huì)造成樹(shù)干、大枝樹(shù)皮組織損傷,骨干枝部位縱裂,影響水分和養(yǎng)分供給,還會(huì)使樹(shù)勢(shì)生長(zhǎng)減弱,腐爛病、干腐病等病害蔓延,以至于死樹(shù)毀園,造成嚴(yán)重危害[2]。
庫(kù)爾勒香梨屬于新疆梨種(Pyrus sinkiangensis Yü),是新疆傳統(tǒng)地方品種。2002年巴州庫(kù)爾勒香梨種植面積達(dá)3.33×104hm2[3],至2010年底達(dá)3.61×104hm2。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培馴化,使香梨具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性。然而,由于不利的氣候條件及近30年的氣候異常等,已嚴(yán)重影響庫(kù)爾勒香梨的正常生長(zhǎng)發(fā)育,甚至因越冬傷害導(dǎo)致大量樹(shù)體死亡[4]。本文通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定越冬期間香梨樹(shù)干形成層保護(hù)酶活性變化特性,為后續(xù)的香梨越冬防護(hù)工作提供一定的科學(xué)依據(jù)。
試驗(yàn)在新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州庫(kù)爾勒市上戶(hù)鎮(zhèn)哈拉蘇村金友聯(lián)果品有限公司果園進(jìn)行。該地區(qū)屬于暖溫帶大陸性干旱氣候(E 86°08',N 41°45'),多年平均總?cè)照諘r(shí)數(shù)2990 h,年平均氣溫13.2℃,年極端最低氣溫-28℃,年極端最高氣溫38.2℃,1~3月逐日最低氣溫平均值-19℃,逐日最高氣溫平均值22℃;年降水量55 mm,年最大蒸發(fā)量為2788.2 mm,無(wú)霜期210 d,主風(fēng)風(fēng)向?yàn)闁|北風(fēng),海拔高度931.5 m。土壤母質(zhì)為山前沖積扇上緣,土壤類(lèi)型為荒漠風(fēng)沙土,1 m土層土壤質(zhì)地為沙礫至沙土[3-5]。試驗(yàn)材料為庫(kù)爾勒香梨,試驗(yàn)果園面積24 hm2(四圍也是梨園),梨樹(shù)株行距為4 m×5 m,株齡8年,樹(shù)干胸徑12~15 cm。
1.2.1 取樣方法
取樣時(shí)間為2009年1月22日、2月19日、3月21日。選取8棵(重復(fù))直徑相仿、株齡8年且健康的梨樹(shù),在離地50~60 cm高的樹(shù)干陰、陽(yáng)面鑿取包括韌皮部、形成層2.5 cm寬,5 cm長(zhǎng)的樹(shù)皮組織(不取木質(zhì)部)樣本并截取3~4個(gè)帶芽的當(dāng)年生枝條,然后把樹(shù)皮組織樣本和枝條分別截至2 cm長(zhǎng),干凈紗布包裹,標(biāo)記后放入液氮罐中,由于需測(cè)定數(shù)據(jù)較多,先將樣品轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室后置于-30℃冰箱中保存,時(shí)間不超過(guò)24 h。
酶液提?。悍Q(chēng)取鮮樣0.1~0.2 g于預(yù)冷的研缽中,加入2 mL預(yù)冷的提取介質(zhì)(50 mmol·L-1,pH 7.8的磷酸緩沖液,內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮)研磨至勻漿,再加入提取介質(zhì)充分研磨沖洗,使終體積為5 mL,4℃下15000 g超速冷凍離心15 min,上清液即為酶提取液。
1.2.2 酶活性測(cè)定
SOD活性測(cè)定采用NBT(氮蘭四唑)顯色法[6];POD活性測(cè)定采用李合生等方法[7];CAT活性測(cè)定采用分光光度法,利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性[8]。每個(gè)樣品測(cè)定5次。
1.2.3 樹(shù)干形成層溫度的測(cè)定
測(cè)量點(diǎn)取果園中心位置;相鄰兩行中選取健康的梨樹(shù)3棵(重復(fù)),在樹(shù)干陽(yáng)、陰面離地面50~60 cm高處樹(shù)皮形成層與樹(shù)皮中間插入植物體內(nèi)熱電偶溫度傳感器(型號(hào):AV-AT),采用AR5數(shù)據(jù)采集器采集連續(xù)3個(gè)月的溫度數(shù)據(jù),詳細(xì)監(jiān)測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。
采用DPS軟件對(duì)庫(kù)爾勒香梨不同部位形成層酶活性進(jìn)行多重比較,用Excel統(tǒng)計(jì)酶活性與溫度的關(guān)系。
1~3月樹(shù)干形成層溫度變化與氣溫高低關(guān)系密切(見(jiàn)表1),當(dāng)氣溫升高時(shí),太陽(yáng)輻射增強(qiáng),樹(shù)干形成層溫度也隨之升高,反之亦然。隨著氣溫升高,形成層極端最低、最高溫度都有所升高。
表1 氣溫與樹(shù)干形成層溫度變化關(guān)系Table 1 Temperature change relationship between air and trunk cambium(℃)
1~3月陽(yáng)面和陰面樹(shù)干形成層極端溫度有所差異(見(jiàn)表1)。陽(yáng)面形成層極端最低溫度均低于陰面,極端最高溫度又均高于陰面。故陽(yáng)面形成層溫度日溫差大于陰面,陽(yáng)面日溫差最高值出現(xiàn)在2009年1月17日,達(dá)33.14℃,比陰面日溫差高17.14℃。冬季由于林木進(jìn)入休眠期,抗凍性增強(qiáng),但抗相對(duì)高溫能力下降。因此,日灼傷害在樹(shù)干陽(yáng)面出現(xiàn)幾率比陰面大[9]。
樹(shù)干形成層溫度24 h變化:1月份日出前陰面形成層溫度略高于陽(yáng)面,日出后陽(yáng)陰面形成層溫度都呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì),陽(yáng)面增幅高于陰面,14:00左右達(dá)到高峰值,隨后溫度持續(xù)下降,日落后陰面溫度降幅小于陽(yáng)面,陽(yáng)面溫度略低于陰面;2月份樹(shù)干陽(yáng)陰面形成層溫度變化與1月份相似,峰值出現(xiàn)在15:00左右,溫差達(dá)15℃左右;3月份日出前陰面溫度略高,日出后陽(yáng)陰面形成層溫度快速升高,陽(yáng)面增幅較快,峰值出現(xiàn)在16:00左右,隨后溫度開(kāi)始下降,陽(yáng)面溫度降幅較大。
由表2可知,同一個(gè)部位2月份酶活性均比其在1月份和3月份數(shù)據(jù)高,但各不同部位SOD酶活性差異不顯著。在持續(xù)低溫下,陽(yáng)面酶活性較高,因?yàn)槎┐撼跗陂g,白天氣溫在0℃以上,夜間氣溫小于等于0℃,晝夜溫差常達(dá)10℃以上,樹(shù)皮向陽(yáng)面受陽(yáng)光直射,增溫快,溫差大,使形成層組織受損,細(xì)胞內(nèi)將產(chǎn)生過(guò)多的活性氧,迫使陽(yáng)面形成層內(nèi)將產(chǎn)生大量SOD,清除細(xì)胞中的自由基,以免機(jī)體受到損害[10]。
表2 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干不同組織器官SOD活性變化Table 2 SOD activities variation in parts of Fragrant Pear trunk
超氧化物歧化酶活力變化趨勢(shì)為先升后降。因降溫初期梨樹(shù)在低溫條件下,體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的超氧物陰離子自由基,為維持體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài),需要高活力的SOD酶來(lái)清除過(guò)多的自由基。但隨著溫度的降低,當(dāng)溫度下降到超過(guò)各產(chǎn)量對(duì)寒冷的忍耐限度,自由基產(chǎn)生過(guò)多,細(xì)胞發(fā)生膜脂氧化作用,從而SOD活性一直降低[11]。樹(shù)體將遭到比較嚴(yán)重的凍害,高濃度的自由基超過(guò)傷害“閾值”,必將導(dǎo)致酶蛋白分子的破壞,從而降低超氧化物歧化酶活力,超氧化物歧化酶活性降低。
由表3可知,越冬期間庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干形成層POD的活性變化與SOD活性變化的總體趨勢(shì)相似,即先上升后下降。
表3 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干不同組織器官POD活性變化Table 3 POD activities variation in parts of Fragrant Pear trunk
同一個(gè)部位2月份酶活性均比其在1月份和3月份數(shù)據(jù)高,庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干陽(yáng)面、陰面形成層的POD活性都存在顯著性差異;在1月份和2月份枝條和芽中的POD活性差異不顯著,而3月份枝條和芽的POD活性達(dá)顯著差異。低溫下,陽(yáng)面和陰面形成層的POD活性較高,芽的活性最低,陽(yáng)面POD活性約是芽中的兩倍,即老化組織中POD活性較高,幼嫩組織POD活性較低。這是因?yàn)镻OD能使組織中的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素,增加木質(zhì)化程度[12],所以POD可作為判斷組織老化的一種生理指標(biāo)。
由表4可知,同一個(gè)部位2份月CAT活性均比其在1月份和3月份活性高,樹(shù)干陽(yáng)面、陰面形成層的CAT活性存在顯著差異;枝條、芽在1月份和3月份存在顯著差異,在2月份差異不顯著;持續(xù)低溫下,陽(yáng)面CAT活性較高。CAT催化H2O2分解為H2O和O2,可清除植物體內(nèi)的氧自由基,防止氧自由基對(duì)植物組織的傷害。
表4 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干不同組織器官CAT活性變化Table 4 CAT activities variation in parts of Fragrant Pear trunk
庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干形成層CAT活性變化比較平緩,隨著溫度降低,其活性升高;隨著溫度升高,CAT活性表現(xiàn)為下降,表明CAT活性與組織中H2O2含量和植物的抗逆性密切相關(guān)。
在逆境脅迫下,細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧,給細(xì)胞帶來(lái)一定傷害。SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的保護(hù)酶之一,超氧自由基是生物細(xì)胞某些生理生化反應(yīng)常見(jiàn)的中間產(chǎn)物,是活性氧的一種[13]。SOD能通過(guò)歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基,生成H2O2和O2-,H2O2由CAT催化生成H2O和O2,從而減少自由基對(duì)有機(jī)體的毒害。SOD活性高低以及在逆境中其活性變化趨勢(shì)在一定程度上可反映植物抗逆性的強(qiáng)弱。POD具有雙重作用:一方面POD可在衰老或逆境的初期表達(dá),清除H2O2,表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng),作為細(xì)胞活性氧保護(hù)酶系統(tǒng)成員之一;另一方面POD可在衰老或逆境的后期表達(dá),作為衰老組織中不斷累積活性氧的來(lái)源之一[14]。本試驗(yàn)主要體現(xiàn)POD的清除作用。植物在逆境下或衰老時(shí),由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。CAT可以催化H2O2分解成H2O和O2,使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成有害的羥自由基。
綜上所述,庫(kù)爾勒香梨植株的保護(hù)酶活性強(qiáng)弱與活性氧的積累量、樹(shù)木受損傷程度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。保護(hù)酶在面對(duì)低溫脅迫時(shí)表現(xiàn)出一定的活躍性來(lái)維持植物正常的生理功能。酶活性的最高值之所以沒(méi)有出現(xiàn)在平均氣溫最低的1月份,而是出現(xiàn)在平均氣溫相對(duì)較低的2月份,是因?yàn)?月份處于冬季末端,冷熱交替明顯,晝夜溫差極大,氣溫不穩(wěn)定,凍融結(jié)合使樹(shù)體受損更為嚴(yán)重,日灼和凍害同時(shí)對(duì)香梨造成的傷害程度為冬季中最大,導(dǎo)致香梨體內(nèi)活性氧較1月份增多,從而引起保護(hù)酶活性增強(qiáng)。這一現(xiàn)象與2月份形成層平均日較差為3個(gè)月份中最大相吻合。進(jìn)入3月份,溫度上升,低溫脅迫減弱,日灼和凍害同時(shí)發(fā)生作用的效果降低,活性氧含量減小,保護(hù)酶活性下降。冬季特別是冬末春初期間的冷熱變化、凍融交替和溫度驟變,使枝干(尤其是樹(shù)干)組織損傷,出現(xiàn)皮層局部死亡,甚至形成層和木質(zhì)部外層也死亡[1]。因此著重在2月份加強(qiáng)樹(shù)木的防護(hù)工作,防止日灼與凍害同時(shí)作用帶給樹(shù)木的傷害。
冬季日灼現(xiàn)象的存在是導(dǎo)致形成層溫度劇烈變化,保護(hù)酶活性變化的重要原因。庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干陽(yáng)面形成層溫度變化比陰面強(qiáng)烈,這與冬季香梨直接受陽(yáng)光暴曬而升溫有關(guān);越冬期間樹(shù)干陽(yáng)面日灼傷害并不只是細(xì)胞間持續(xù)結(jié)冰導(dǎo)致的,是強(qiáng)光使樹(shù)干陽(yáng)面組織反復(fù)升溫降溫,組織抗寒性降低所致[8]。從保護(hù)酶活性的變化特征分析得知,冬季既有低溫脅迫,還有不為人們所熟知的日灼傷害。
a.保護(hù)酶活性隨著形成層溫度的降低而升高,但同時(shí)受日灼影響。保護(hù)酶活性的變化反映出香梨樹(shù)木受損害的程度。越冬期間,凍害和日灼共同作用造成對(duì)樹(shù)木的傷害,其中2月份受日灼和凍害共同作用最為嚴(yán)重,因此有必要在此期間采取遮蔭等措施防止日灼,從而減輕日灼和凍害同時(shí)對(duì)樹(shù)干的傷害。
b.庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干形成層陽(yáng)陰面的SOD活性差異不顯著,而POD、CAT活性達(dá)差異極顯著,因此POD和CAT可作為樹(shù)干日灼傷害的指標(biāo)。由于越冬期間香梨樹(shù)干無(wú)葉片遮蔭,太陽(yáng)輻射直接暴曬樹(shù)干陽(yáng)面,使陽(yáng)面形成層溫度日變化比陰面劇烈,形成層中活性氧增多,促使保護(hù)酶活性變化增強(qiáng),陽(yáng)面受日灼和凍害同時(shí)作用的可能性遠(yuǎn)大于陰面。
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