水稻葉綠素含量的動態(tài)QTL剖析

姜樹坤，張喜娟，王嘉宇，徐正進，陳溫福，張鳳鳴*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，哈爾濱 150086；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，沈陽 110161）

水稻（Oryza sativa L.）生物產(chǎn)量95%來自于葉片光合作用，而葉綠素是其光合作用關(guān)鍵。對于“增加光合速率是否能增加最終產(chǎn)量”這一問題仍有爭議，但最近的研究表明高產(chǎn)品種往往具有較高的光合速率和較高的葉綠素含量[1]。對衣藻和擬南芥等模式生物研究已闡明葉綠素生物合成和降解的基本過程[2-3]。雖然對葉綠素合成和降解途徑的研究有一定進展，但關(guān)于該過程在水稻整個發(fā)育過程中的分子調(diào)節(jié)機制仍不了解。隨著數(shù)量遺傳學(xué)理論和相關(guān)分析軟件的不斷發(fā)展和完善，利用分子標記進行QTL定位分析在水稻重要農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)研究中發(fā)揮重要作用[4-7]。研究表明，葉綠素的合成與降解在水稻整個生育期是一個動態(tài)過程[8]，生育前期葉綠素含量逐漸增加，生育后期葉綠素含量降低，葉綠素含量降低往往暗示葉片衰老、營養(yǎng)缺乏或遭遇逆境。因此，葉綠素含量的動態(tài)變化作為稻作研究和生產(chǎn)實踐的重要參考指標，明確葉綠素含量在不同時期變化的遺傳基礎(chǔ)，將有利于合理采取對應(yīng)措施，充分發(fā)揮品種高產(chǎn)潛力。

本研究通過對沈農(nóng)265/麗江新團黑谷的RILs群體在水稻分蘗盛期、抽穗期和成熟期的葉綠素含量變化進行QTL分析，旨在剖析水稻葉綠素不同時期的表達規(guī)律，為超高產(chǎn)水稻育種和后期功能型水稻品種選育及改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以葉綠素含量較高的北方超級粳型常規(guī)稻品種沈農(nóng)265（SN265）為母本，以葉綠素含量較低的云南地方粳稻品種麗江新團黑谷（LTH）為父本進行雜交，經(jīng)單粒傳7代衍生構(gòu)建粳/粳交重組自交系群體（命名為SL-RILs）。該群體由126個株系組成，遺傳穩(wěn)定。其對應(yīng)的連鎖圖譜包括121個標記，包含119個SSR標記和2個形態(tài)學(xué)標記（紫色稃尖C和直立穗型EP）。該圖譜覆蓋水稻12條染色體，總長度為1397.50 cM，標記間平均距離為11.55 cM[9]。

1.2 田間試驗及葉綠素測定

試驗于2009年在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所試驗田進行，4月12日育苗，5月18日移栽，126個RILs家系采用2次重復(fù)的隨機區(qū)組設(shè)計，每小區(qū)4行，每行10株，栽植的行株距為30 cm×13.3 cm，其他管理同生產(chǎn)田。由于沈農(nóng)265（102 d）和麗江新團黑谷（105 d）的抽穗期僅差3 d，且RIL群體的抽穗期變異范圍小于10 d[10]，因此所有株系可以統(tǒng)一調(diào)查。分別于分蘗期（6月25日）、抽穗期（7月28日）和成熟期（9月21日）用葉綠素儀（SPAD-502．Monito，Japan）測定親本及各家系最上端葉片的葉綠素含量。取葉片中部重復(fù)測定3次，每個家系測定20片葉，取平均值用于換算該家系的葉綠素含量。葉綠素儀測定的SPAD值與葉綠素含量之間換算的公式為Y=0.1285X-0.5656，式中，X為葉綠素儀的測定值（SPAD值），Y為葉綠素含量（mg·dm-2）[11]。

1.3 動態(tài)QTL分析

取每個調(diào)查時刻各株系葉綠素含量的平均值，即為t時刻（y（t））的表型值，根據(jù)朱軍提出的條件遺傳效應(yīng)值的統(tǒng)計分析方法[12]，采用QGA Station 1.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，可以獲得給定的t-1時刻表型值的 y（t）時刻條件表型值 y（t|t-1）。非條件QTL的加性效應(yīng)反映發(fā)育初始時刻至t時刻基因表達的累積效應(yīng)，條件QTL的加性效應(yīng)則為t-1時刻到t時刻基因表達的凈加性效應(yīng)。第1次測定得到的非條件QTL，即為初始時刻至第1次測定時期的條件QTL。

采用WinQTL Cartographer 2.5的CIM方法進行QTL定位[13]，步移速度設(shè)置為1 cM，模型為6，控制標記數(shù)為5，用向前回歸方法，被檢區(qū)間選擇每側(cè)10 cM的控制窗口。采用排列組合1000次的方法確定LOD閾值（α=0.05），當實際求得的LOD值大于LOD閾值時，就認為該區(qū)段存在1個QTL，其置信區(qū)間為LOD峰值向下1個LOD值單位的區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個生育時期葉綠素含量表現(xiàn)

沈農(nóng)265的葉綠素含量在3個不同的生育時期（分蘗期、抽穗期和成熟期）均極顯著大于麗江新團黑谷（見表1）。3個性狀皆在SL-RILs群體中表現(xiàn)為連續(xù)的正態(tài)分布，且呈現(xiàn)明顯的超親遺傳，表明群體中各個株系間基因型差異較大，適于進行QTL分析。

表1 親本和RILs群體在3個不同時期的葉綠素含量Table 1 Chlorophyll contents of the parents and the RIL population at three different stages

2.2 3個生育時期葉綠素含量的QTL定位

共檢測到控制水稻分蘗期、抽穗期和成熟期葉綠素含量的22個QTL，分布在除第5染色體以外的11條染色體上，其中與分蘗期葉綠素含量相關(guān)的5個；與抽穗期葉綠素含量相關(guān)的7個；與成熟期葉綠素含量相關(guān)的10個（見表2，圖1）。在3個時期同時檢測到的1個，在2個時期同時檢測到的3個。控制分蘗期葉綠素含量的5個QTL分布于第3、6、9和10號染色體上，增效等位基因均來自SN265，其中表型貢獻率大于20%的為qCT3a和qCT9。控制抽穗期葉綠素含量的7個QTL分布于第1、2、3、4、7、8和9號染色體上，其中qCT2、qCH3、qCH7和qCH9的增效等位基因來自SN265；qCH1、qCH4和qCH8的增效等位基因來自LTH，表型貢獻率大于20%的僅有qCH9?？刂瞥墒炱谌~綠素含量的10個QTL分布于第2、3、4、7、9、10、11和12號染色體上，其中 qCM4a、qCM7a、qCM7b、qCM9、qCM11a和qCM12的增效等位基因來自SN265；qCM2、qCM3、qCM4b、和qCM11b的增效等位基因來自LTH，表型貢獻率大于20%的僅有qCM2，其貢獻率達21.8%。

表2 3個不同生育時期葉綠素含量的QTL定位Table 2 QTL location of chlorophyll content at three different growth stages

圖1 控制3個生育時期葉綠素含量的QTL在染色體上的位置Fig.1 Chromosome location of putative QTL for chlorophyll content at three stages

2.3 3個生育時期葉綠素含量的動態(tài)QTL定位

非條件QTL的加性效應(yīng)可反映發(fā)育初始時刻至t時刻基因表達的累積效應(yīng)，條件QTL加性效應(yīng)則為t-1時刻到t時刻基因表達的凈加性效應(yīng)。對應(yīng)本研究就是非條件QTL反應(yīng)的是從生育起始至3個不同時期的累積效應(yīng)，而條件QTL反應(yīng)的是從分蘗至抽穗和從抽穗至成熟這兩個時間段的凈效應(yīng)。在這兩個階段共檢測到14個QTL，其中有控制分蘗期至抽穗期葉綠素含量的位點7個，分別位于第4、7、8、9和11號染色體上?？刂瞥樗肫谥脸墒炱谌~綠素含量的位點也有7個，位于第1、2、3、4、8、10和12號染色體上，未發(fā)現(xiàn)在兩個階段同時表達的位點，反映了控制葉綠素含量機制的復(fù)雜性，這些位點的具體信息見表3。

這些條件QTL為非條件QTL提供確切的解釋。將其分為3類，第一類，非條件QTL與條件QTL檢測結(jié)果完全一致。如第2染色體上檢測到控制抽穗期至成熟期葉綠素含量的位點qCh-m2，該位置我們曾檢測到控制成熟期葉綠素含量的非條件QTL-qCM2，以上信息表明該位點是在水稻抽穗以后才表達的；第二類，條件QTL只在某一時期表達，而非條件QTL卻能在多個時期重復(fù)出現(xiàn)。如第4染色體上檢測到的控制分蘗期至抽穗期葉綠素含量的位點qCt-h4，該位置曾檢測到控制抽穗期葉綠素含量的非條件QTL-qCT4和控制成熟期葉綠素含量的非條件QTL-qCM4。qCt-h4的信息暗示其在分蘗期以后表達直至抽穗期結(jié)束，而在成熟期還能檢測到該位點是由于葉綠素在分蘗期至抽穗期的表達累積所致；第三類，條件QTL能檢測到，而非條件QTL檢測不到。如第1染色體和第8染色體上控制抽穗期至成熟期葉綠素含量的位點qCh-m1和qCh-m8，這兩個位點均是在抽穗期以后表達，但由于前期葉綠素積累較多，使得先前在檢測成熟期葉綠素含量QTL位點時卻沒有檢測到。

表3 三個不同生育時期葉綠素含量的非條件QTL的位置及效應(yīng)Table 3 Location and effects of unconditional QTL controlling chlorophyll content at three different growth stages

3 討論

“源-庫-流”的協(xié)調(diào)是水稻獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵，只有“源”足、“庫”大，同時“流”暢才能獲得較高的產(chǎn)量。目前人們的研究重點集中在對“庫”的研究，大量的“庫”相關(guān)性狀基因被克隆，如控制單株產(chǎn)量的qGY2-1[14]，控制每穗粒數(shù)的 Gn1a[5]，Ghd7[15]，DEP1[16]和 IPA1[17]， 控 制 籽 粒 大 小 的 GW2[6]、GS3[7]和 qSW5[18]，以及控制灌漿的GIF1[19]等等，而對于“源”和“流”的研究相對較少。主要是因為“源”和“流”的性狀難以直接測定，同時遺傳機制復(fù)雜且易受環(huán)境因素影響。本研究將研究重點放在重要的“源”性狀—葉片的葉綠素含量上，期望研究結(jié)果能夠為水稻高產(chǎn)育種提供理論支持。

在水稻整個生育期，葉綠素的合成與降解是一個動態(tài)過程[8]。為探討水稻葉片葉綠素含量變化規(guī)律和遺傳規(guī)律，本研究小組通過對SL-RILs群體在分蘗期、抽穗期和成熟期的葉綠素含量進行動態(tài)QTL分析，共檢測到22個條件QTL和14個非條件QTL。一般而言，非條件QTL的加性效應(yīng)可反映發(fā)育初始時刻至t時刻基因表達的累積效應(yīng)，條件QTL加性效應(yīng)則為t-1時刻到t時刻基因表達的凈加性效應(yīng)。比對發(fā)現(xiàn)，非條件QTL給條件QTL提供較好解釋，尤其是部分非條件QTL只在特定的時期表達，而條件QTL卻能在多個時期重復(fù)出現(xiàn)，由此亦反映出水稻葉綠素含量遺傳的復(fù)雜性。此外，與其他研究小組結(jié)果相比[20-24]，定位在第1染色體RM428-RM580區(qū)段、第3染色體RM426-RM514區(qū)段、第4染色體RM470-RM559區(qū)段、第8染色體RM408-RM25區(qū)段和第9染色體RM566-RM242區(qū)段的位點在不同群體中的重演性很好，有一定應(yīng)用價值。其中，第3染色體qCT3a、qCH3、qCM3以及第9染色體qCT9、qCH9b和qCH9等區(qū)域是提高葉綠素含量的重要功能區(qū)。劉化龍等研究表明，水稻生育后期的葉綠素含量對最終產(chǎn)量影響很大，可以作為高光效育種和超高產(chǎn)育種的關(guān)鍵指標[25]。本研究其中檢測到的控制抽穗期到成熟期葉綠素含量的QTL可以作為分子輔助育種的重要“元件”，對這些區(qū)域開發(fā)穩(wěn)定并易于檢測的分子標記，可用于品種的分子改良。

4 結(jié)論

以沈農(nóng)265和麗江新團黑谷的粳-粳交重組自交系為材料，對水稻分蘗期、抽穗期和成熟期的葉綠素含量進行動態(tài)QTL分析。共檢測22個條件QTL和14個非條件QTL，分布在第5條染色體以外的11條染色體上?？刂品痔Y期、抽穗期和成熟期葉綠素含量的條件QTL分別有5個、7個和10個；控制分蘗期—抽穗期和抽穗期—成熟期葉綠素含量的非條件QTL各有7個。檢測到的控制生育后期葉綠素含量的QTL可以作為分子輔助育種的重要“元件”，用于品種的分子輔助改良。

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