炭氣凝膠納米顆粒固定葡萄糖氧化酶的直接電化學(xué)

于志輝 宿婷婷 任翠華 李 釩 夏定國程水源

(1北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院,北京100124;2北京大學(xué)工學(xué)院,北京100871)

1 引言

酶是一種具有生物活性的蛋白質(zhì),酶的氧化還原活性中心與載體之間的直接電化學(xué)研究已成為生物電化學(xué)研究最重要的發(fā)展方向之一,1-5葡萄糖氧化酶(GOD)是一個(gè)具有剛性結(jié)構(gòu)的氧化還原酶,由兩條相同的多肽鏈組成的二聚體分子構(gòu)成,每條肽鏈中包含一個(gè)氧化還原中心——黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2),6具有較高的催化活性和高度的穩(wěn)定性,成為生物電化學(xué)研究領(lǐng)域中的一種理想的酶;所以將GOD用合適的方法固定在電極表面作為催化劑己得到廣泛關(guān)注.7-11而具有良好的導(dǎo)電性能和生物性能的酶載體研究,是酶的直接電化學(xué)的研究重點(diǎn).12-18影響酶在電極上的直接電化學(xué)性能行為因素主要有兩方面:一是電極上載體的空間結(jié)構(gòu),大小匹配的空間結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)進(jìn)入到相應(yīng)的位置中,保持合適的二級結(jié)構(gòu),從而完成電子的直接轉(zhuǎn)移;二是載體的導(dǎo)電率,具有良好電子導(dǎo)電的載體能夠在蛋白質(zhì)和電極之間提供良好的電子通道,研究發(fā)現(xiàn)如果直接將酶吸附在平面型載體上,其電化學(xué)性能不好,但是如果是粗糙表面,其電化學(xué)性能則發(fā)生明顯改善.

炭氣凝膠是一種新型輕質(zhì)納米多孔無定形炭素材料,具有導(dǎo)電性好、多孔結(jié)構(gòu)等性能,被廣泛應(yīng)用于催化劑載體研究,19,20將炭氣凝膠應(yīng)用于葡萄糖生物傳感器中,可表現(xiàn)出較高的靈敏性、抗干擾性和較好的穩(wěn)定性,目前納米介孔炭氣凝膠固定葡萄糖氧化酶的直接電化學(xué)研究尚未見報(bào)道.以介孔炭氣凝膠為電極催化劑載體材料固定葡萄糖氧化酶,一方面利用納米介孔材料實(shí)現(xiàn)酶催化劑的高表面原子分布進(jìn)而提高傳統(tǒng)催化劑的活性,另一方面酶與電極之間直接電子傳遞過程更接近生物氧化還原的原始模型,用電極充當(dāng)電子的給予體或接受體,可以模擬生物體系電子傳遞機(jī)理,對了解生物分子的結(jié)構(gòu)和各種物理化學(xué)性質(zhì)具有重要的意義.本研究利用間苯二酚和甲醛在堿性環(huán)境下制備炭氣凝膠,用其固定葡萄糖氧化酶修飾玻碳電極,在無電子媒介體的情況下,研究其直接電化學(xué)性能以及對葡萄糖的催化性能.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4,from Asperillus niger,147 units·mg-1,glucose oxidase,GOD)(Sigma公司);2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)Nafion溶液(美國Aldrich化學(xué)公司);緩沖溶液為0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(PBS).其余試劑均為分析純試劑.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.葡萄糖儲備溶液在使用前24 h配制,以完成其構(gòu)型的轉(zhuǎn)換.

PB-10酸度計(jì)(德國賽多利斯公司);PARSTAT2273電化學(xué)分析工作站(美國PAR公司);HITACHI S-4300掃描電子顯微鏡(日本日立公司); BET(ASAP 2010型美國亞特蘭大Micromeritics Instrument Corporation);METTLER TOLEDO AL104-1C分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司); KQ-2200B超聲波清洗器(中國昆山市超聲儀器有限公司).

2.2 炭氣凝膠固定葡萄糖氧化酶修飾玻碳(GOD/CA/GC)電極的制備

利用間苯二酚和甲醛在堿性環(huán)境下制備炭氣凝膠(CA).21稱取CA樣品10 mg,加入1 mL 95%(w)的乙醇中,超聲30 min后,再加入20 mg的GOD,機(jī)械搖勻,在4°C條件下放置24 h獲得GOD/CA懸濁液.稱取CA樣品,用上述方法配置CA懸濁液.

將玻碳(GC)電極分別用粒徑為0.3和0.05 μm的氧化鋁漿打磨至光亮,在超聲狀態(tài)下依次用二次蒸餾水、無水乙醇和二次蒸餾水清洗GC電極.干燥后用微量進(jìn)樣器分別取8 μL GOD/CA、CA懸濁液滴到不同的GC電極表面.半干后,再滴加2 μL 0.1%Nafion溶液,室溫下自然干燥,得到待測GOD/ CA/GC電極和CA/GC電極.

2.3 CA的結(jié)構(gòu)表征及GOD/CA/GC的電化學(xué)性能測試

采用HITACHI S-4300掃描電子顯微鏡觀察載體CA材料的表面形貌;BET測試在Micromeritics ASAP 2010(美國麥克儀器公司)上進(jìn)行;傅里葉紅外(FTIR)光譜測量在Nicolet 360 FTIR紅外光譜儀上進(jìn)行.電化學(xué)測試在室溫下進(jìn)行,采用三電極系統(tǒng):鉑電極作為對電極,飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極,分別以CA/GC、GOD/CA/GC電極(直徑4 mm)為工作電極.在pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的PBS中測定GOD/CA/GC的循環(huán)伏安曲線.循環(huán)伏安掃描的電壓范圍為-0.68 V至-0.28 V(vs SCE).利用循環(huán)伏安法在pH=7.0的緩沖體系中測定不同葡萄糖濃度中GOD/CA/GC電極對葡萄糖的催化性能.

3 結(jié)果與討論

3.1 CA表面結(jié)構(gòu)分析

圖1 載體材料CA的SEM圖Fig.1 SEM image of carrier material CA

圖2 載體材料CA的TEM圖Fig.2 TEM image of carrier material CA

圖1給出了利用間苯二酚和甲醛在堿性環(huán)境下制備的炭氣凝膠(CA)載體材料的SEM圖,放大倍數(shù)為50000倍,從中可以看到炭氣凝膠載體表面為顆粒堆積形貌,顆粒大小約為200 nm,該表面可形成較大的比表面積從而有利于酶的附著.圖2為CA載體材料的TEM圖,從圖中可以看出樣品具有高度有序的微孔道結(jié)構(gòu),它們是由許多球狀的介孔籠通過窗口相互連接排列而成.

圖3為CA載體材料的N2吸脫附等溫線和孔徑分布圖,可以看出CA載體材料的N2吸脫附等溫線中有典型的IV型等溫線并伴隨有一個(gè)較明顯的滯后環(huán),表明CA載體材料有介孔結(jié)構(gòu)存在.孔徑分布圖表明孔徑分布范圍主要集中在10 nm左右,與GOD的尺寸(7-8 nm)相接近,BET的測試結(jié)果表明CA載體材料比表面積為586 m2·g-1,大小匹配的介孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積均有利于吸附固定GOD.圖4為CA載酶前后的氮吸脫附等溫曲線的對比圖,可以看出CA在固定葡萄糖氧化酶后與固定前的N2吸脫附曲線相比有明顯改變，載酶后N2的吸附量明顯降低,比表面積的測試結(jié)果為80 m2·g-1，表明GOD已固定到載體CA上.22

圖3 CA的氮吸脫附等溫曲線(A)和孔徑分布圖(B)Fig.3 N2adsorption-desorption isotherm(A)and pore size distribution curve(B)of CA

圖4 CA載酶前(A)和載酶后(B)氮吸脫附等溫曲線Fig.4 N2adsorption-desorption isotherms of CAbefore (A)and after(B)impregnation with GOD

圖5為CA、GOD、GOD/CA的紅外吸收光譜圖.在蛋白質(zhì)的紅外光譜中,酰胺I和酰胺II是蛋白質(zhì)肽鏈二級結(jié)構(gòu)的特征吸收,酰胺I是蛋白質(zhì)肽鏈骨架上C―O伸縮振動(dòng)引起的,酰胺II則是N―H面內(nèi)彎曲和C―N伸縮振動(dòng)共同引起的,根據(jù)酰胺I和酰胺II的峰位置的變化可以判斷蛋白質(zhì)是否變性.22其中GOD的紅外吸收光譜在1649和1538 cm-1處的吸收峰分別對應(yīng)的是GOD的酰胺I和酰胺II,在1105 cm-1處對應(yīng)的是GOD上C―O鍵的伸縮振動(dòng);GOD/ CA的紅外吸收光譜在1635和1540 cm-1處仍有較強(qiáng)的吸收峰對應(yīng)GOD的酰胺I和酰胺II,在1119 cm-1處吸收峰對應(yīng)GOD上C―O鍵的伸縮振動(dòng),可以看出,用該種方法固定GOD保持了其天然構(gòu)象.

圖5 CA、GOD和GOD/CA的紅外吸收光譜圖Fig.5 IR spectra of the samples CA,GOD,and GOD/CA

3.2 GOD/CA/GC電極的直接電化學(xué)研究

圖6為CA/GC和GOD/CA/GC電極在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線(CV),從圖中可以看出CA/GC電極在掃描電位范圍內(nèi)沒有任何可觀察到的電化學(xué)反應(yīng)發(fā)生,而GOD/CA/GC電極在-471和-512 mV(vs SCE)出現(xiàn)了一對明顯的氧化還原峰,其式量電位E0?為-491.5 mV,峰電位差ΔEp為41 mV,顯示了GOD在電極表面快的電子傳遞和良好的可逆性,表明GOD很好地固定在電極上,保持了很好的電化學(xué)活性.

圖6 CA/GC和GOD/CA/GC電極在0.1 mol·L-1 PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線Fig.6 Cyclic voltammograms of CA/GC and GOD/CA/ GC electrodes at a solution of 0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0) PBS:phosphate buffered solution

圖7 (A)GOD/CA/GC電極在不同掃描速率(v)下的循環(huán)伏安曲線和(B)GOD/CA/GC電極陰極、陽極峰電流與掃描速率的線性關(guān)系Fig.7 (A)Cyclic voltammograms of the GOD/CA/GC electrode at different scan rates(v);(B)plots of the redox peak currents vs scan rate

圖7A為GOD/CA/GC電極在不同掃描速率下得到的CV,可以看出峰電流隨掃描速率的增大而增大,電極電流與掃描速率呈線性關(guān)系(見圖7B),說明GOD的電化學(xué)反應(yīng)受表面控制,23表明GOD很好地固定在CA/GC電極表面.隨著掃描速率的增加,陽極、陰極峰電位分別向正、負(fù)方向產(chǎn)生較小的偏移,ΔEp增加,但E0?幾乎不變.由Laviron公式:24Ks= mnFv/RT(Ks:電子轉(zhuǎn)移速率,s-1;m:與峰電位差相關(guān)的參數(shù);n:電子轉(zhuǎn)移數(shù);F:法拉第常數(shù),96485 C· mol-1;v:掃描速率,mV·s-1;R:氣體常數(shù),J·mol-1· K-1;T:熱力學(xué)溫度,K)可計(jì)算出GOD/CA/GC電極的Ks約為5.72 s-1,與已報(bào)道文獻(xiàn)數(shù)據(jù)22,25,26相比該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GOD/CA/GC電極具有較高的電子轉(zhuǎn)移速率,說明GOD/CA/GC電極上固定的GOD具有較快的電子傳遞過程,CA/GC電極表面的微環(huán)境更有利于GOD的直接電子轉(zhuǎn)移.

圖8A為GOD/CA/GC電極在不同pH值下的循環(huán)伏安曲線.GOD/CA/GC電極的CV行為在很大程度上受溶液pH值的影響.溶液pH值的增加通常會導(dǎo)致其CV還原氧化峰電位的負(fù)移,從圖8B式量電位與pH值的關(guān)系中可以看出,在pH=6.0-8.0范圍內(nèi),電位(單位為V)隨著pH值的變化而線性變化,且線性相關(guān)系數(shù)R=0.99453,求得其斜率為66.68,與公式E0?=constant+0.059pH中的理論值(59)24非常接近.表明該GOD/CA/GC電極上發(fā)生了直接電化學(xué)反應(yīng):GOD-FAD+2e-+2H+=GOD-FADH2,FAD為黃素腺嘌呤二核苷酸,該反應(yīng)伴隨有兩電子兩質(zhì)子的轉(zhuǎn)移,且GOD在電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)具有較好的可逆性.

圖8 (A)GOD/CA/GC電極在不同pH值下循環(huán)伏安曲線和(B)式量電位與pH值的關(guān)系圖Fig.8 (A)Cyclic voltammograms of GOD/CA/GC electrode at various pH values;(B)plot of E0?of GOD/CA/GC vs pH value of the solution

Nafion是一種很好的固定膜,但對于電子的傳遞有一定的阻礙作用,對于GOD/CA/GC電極,在Nafion質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、0.2%、0.1%,PBS濃度為0.1 mol·L-1、掃描速率為100 mV·s-1的條件下進(jìn)行循環(huán)伏安測試,結(jié)果見圖9.從圖中可以看出隨Nafion濃度的減小,ΔEp值減小;通過計(jì)算得到三種Nafion質(zhì)量分?jǐn)?shù)下Ks依次為1.52,2.96,3.02 s-1,結(jié)果表明選擇低濃度的Nafion有利于電子的傳遞.但濃度進(jìn)一步的降低造成測試過程中活性物質(zhì)脫落.

3.3 GOD/CA/GC電極對葡萄糖的催化性能研究

圖10為GOD/CA/GC電極在不含葡萄糖溶液和含有5 mmol·L-1葡萄糖溶液pH為7的0.1 mol· L-1PBS溶液中100 mV·s-1下的循環(huán)伏安曲線圖.由圖可見,向PBS中加入葡萄糖溶液后還原峰電流的絕對值明顯減小,而氧化峰電流明顯增加,這表明電極上的葡萄糖氧化酶與葡萄糖之間發(fā)生了酶催化反應(yīng),其反應(yīng)表達(dá)式為:

圖9 GOD/CA/GC電極使用不同濃度Nafion(w)的循環(huán)伏安圖Fig.9 Cyclic voltammograms of GOD/CA/GC electrode with different concentrations(w)of Nafion v=100 mV·s-1

圖10 GOD/CA/GCE在不含葡萄糖溶液(a)和葡萄糖濃度為5 mmol·L-1的溶液(b)中的循環(huán)伏安圖Fig.10 Cyclic voltammograms of GOD/CA/GCE in absence(a)and presence(b)of 5 mmol·L-1glucose solution conditions:0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0),v=100 mV·s-1

圖11A為GOD/CA/GC電極對葡萄糖的催化性能測試,從圖中可以看出,當(dāng)連續(xù)加入濃度為0.4 mmol·L-1的葡萄糖溶液時(shí),電流響應(yīng)出現(xiàn)跳躍性增大,電極的電流響應(yīng)時(shí)間小于10 s.隨著葡萄糖的濃度增大,可以觀察到電極響應(yīng)出現(xiàn)了一個(gè)飽和平臺,說明此電極反應(yīng)具有典型的Michaelis-Menten酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征.圖11B為電流響應(yīng)值與葡萄糖濃度的關(guān)系圖,二者在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍為0.4-2.0 mmol·L-1,線性相關(guān)系數(shù)為0.99114.由圖可以得到該電極的靈敏度約為5.33 μA·mmol-1·cm-2,當(dāng)信噪比為3時(shí),電極檢測限為0.266 mmol·L-1.結(jié)果表明GOD/CA/GC電極具有較高的靈敏度和較低檢測限.

圖11 GOD/CA/GC電極對葡萄糖的催化性能圖(A)與電流響應(yīng)值與葡萄糖濃度的關(guān)系(B)Fig.11 Amperometric response of GOD/CA/GC electrode during successive addition of glucose(A)and plots of chronoamperometric current vs glucose concentration(B) conditions:0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0),potential of-480 mV

圖12為干擾物對GOD/CA/GC電極催化葡萄糖性能影響的測試結(jié)果,從圖中可以看出,加入濃度為0.8 mmol·L-1的葡萄糖溶液時(shí)有電流響應(yīng),而當(dāng)分別加入濃度均為0.08 mmol·L-1的抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)和多巴胺(DP)時(shí),電流基本沒有受到影響,表明該電極具有很好的抗干擾性.27

圖12 干擾物對GOD/CA/GC電極催化葡萄糖性能的影響Fig.12 Effect of interfering species on response of GOD/CA/GC eletrode to glucose interfering species dissolved in 0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0),at potential of-480 mV;AA:ascorbic acid,UA:uric acid,DP:dopamine

為了考察GOD/CA/GC電極的重現(xiàn)性,用6根不同的玻碳電極,分別固定GOD/CA,CV測定結(jié)果為6條曲線幾乎重合,說明該電極有很好的重現(xiàn)性;在緩沖溶液中,將電極在100 mV·s-1的掃描速率下連續(xù)掃描90圈,其循環(huán)伏安曲線基本保持不變,工作穩(wěn)定性很好;將GOD/CA/GC電極放在4°C冰箱中保存2天后在緩沖溶液中再次測定其對葡萄糖的催化活性,發(fā)現(xiàn)CV曲線中的電催化電流并沒有明顯的改變,這說明GOD/CA/GC電極具有很好的貯存穩(wěn)定性.

4 結(jié)論

表面結(jié)構(gòu)和孔徑分布結(jié)果表明,CA載體材料具有與葡萄糖氧化酶大小相匹配的介孔結(jié)構(gòu)和較大的表面積,該結(jié)構(gòu)有利于酶的負(fù)載.以CA載體采用吸附法得到GOD/CA/GC電極,該電極在磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線說明,CA載體可以很好地固定GOD并保持其生物活性,且氧化還原峰的電流與掃描速率呈線性關(guān)系,說明電極反應(yīng)受表面控制;GOD/CA/GC電極在不同pH值下循環(huán)伏安曲線分析結(jié)果表明,GOD在電極上實(shí)現(xiàn)了直接電子轉(zhuǎn)移;I-t曲線表明,GOD/CA/GC電極對葡萄糖具有良好的催化性能并表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.

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