葡萄根瘤蚜Taq Man－MGB實時熒光定量檢測方法的研究

郭 慶， 王忠躍， 孔繁芳， 武艷霞

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

葡萄根瘤蚜［Daktulosphaira vitif oliae （Fitch）］，屬于同翅目（Homoptera），根瘤蚜科（Phylloxeridae），是葡萄上的毀滅性害蟲。葡萄根瘤蚜為專食性，只為害葡萄屬（Vitis spp．）植物，是我國植物檢疫性有害生物［1］。該種原產(chǎn)于北美洲落基山脈東部［2－3］，目前在加拿大、阿根廷、智利、秘魯、墨西哥、哥倫比亞、巴西、法國、奧地利、阿爾巴尼亞、比利時、保加利亞、匈牙利、阿爾及利亞、南非、突尼斯、摩洛哥、巴基斯坦、敘利亞、土耳其、黎巴嫩、塞浦路斯、以色列、日本及朝鮮等國均有分布［4－8］。2005年6月在上海市嘉定區(qū)馬陸鎮(zhèn)李家村發(fā)現(xiàn)了葡萄根瘤蚜，以后陸續(xù)在湖南懷化、陜西西安、遼寧葫蘆島等地發(fā)現(xiàn)該蟲［9－11］。葡萄根瘤蚜的再次發(fā)現(xiàn)，引起了農(nóng)業(yè)部的高度重視，并設專項資金進行普查和防控技術研究。由于此蟲體形小，主要在根部寄生，對葡萄的為害往往需要較長時間才開始顯現(xiàn)癥狀，因此不像其他害蟲容易被發(fā)現(xiàn)［12］。目前檢測葡萄根瘤蚜主要方法有DNA檢測、根系調查和捕蟲器調查［13］，而DNA檢測大幅度地提高了檢測的靈敏度。

實時熒光定量PCR技術由美國Applied Biosystems公司于1996年推出，該技術不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高，具實時性和準確性等特點。雖然實時熒光定量PCR在害蟲檢測中的應用剛剛起步，但已經(jīng)顯示出了極好的應用前景。Karen Her bert等報道利用葡萄根瘤蚜的ITS2建立了特異性引物，建立定性檢測葡萄根瘤蚜的實時熒光定量PCR技術［14］，但并未構建標準質粒、標準曲線和完整的實時熒光定量PCR的絕對定量檢測體系，本研究采取Taq Man－MGB探針方法，通過構建標準陽性質粒及標準曲線，對實時熒光定量PCR反應條件進行優(yōu)化，建立完整的實時熒光定量PCR定量檢測體系，對葡萄根瘤蚜及土壤中的若蟲進行定量檢測，旨在為葡萄根瘤蚜的檢測和種群動態(tài)監(jiān)測提供方法。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1.1.1 供試害蟲

葡萄根瘤蚜采自湖南懷化、西安灞橋、上海馬陸3個葡萄根瘤蚜疫區(qū)。

1．1．2 試劑及儀器

Premix Taq Man探針反應液，購自上海基康生物技術有限公司；E．coli感受態(tài)細胞，p MD18－T載體，購自Ta Ka Ra公司；Powersoil土壤DNA分離試劑盒（12888），購自 MOBIO公司；Eppendorf 5415 R離心機，水浴鍋，漩渦震蕩儀，ABI7500熒光定量儀，Ultrospec 2100 pro紫外分光光度儀，BIO－RAD C1000TMPCR儀等。

1．2 試驗方法

1．2．1 引物的驗證

利用Karen Her bert等根據(jù)葡萄根瘤蚜ITS2中的保守序列設計的探針和引物序列，并由上?；瞪锛夹g有限公司合成。引物序列和探針序列見表1。

表1 引物和探針序列

參照安瑞生等的方法［15］提取上海馬陸、西安灞橋和湖南懷化3個地點葡萄根瘤蚜的基因組DNA，以TE溶解，－20℃儲存，用作PCR的模板。PCR反應體系為25μL：滅菌雙蒸水8．75μL、DNA模板3μL，反應緩沖液1．5μL，d NTP混合物1μL、上游引物0．3μL，下游引物0．3μL、Ex－Taq DNA 聚合酶0．15μL，混勻后進行PCR擴增，擴增條件參照Bul man等［16］。同時設立無模板的陰性對照。反應結束后，用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR特異性擴增產(chǎn)物。

1．2．2 標準陽性質粒的制備

1．2．2．1 ITS2目標基因PCR擴增

葡萄根瘤蚜提取方法及PCR體系同1．2．1，反應結束后，用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR特異性擴增產(chǎn)物。

1．2．2．2 ITS2目標基因的克隆與鑒定

參照膠回收試劑盒的操作說明，回收PCR特異性擴增產(chǎn)物，將回收的PCR特異性擴增產(chǎn)物與p MD18－T載體連接，構建重組質粒，并轉化E．coli感受態(tài)細胞，用質粒提取試劑盒提取重組質粒DNA，對重組質粒DNA進行PCR鑒定，將陽性重組質粒送北京三博遠志生物技術公司測序。

1．2．3 標準陽性質粒濃度、拷貝數(shù)計算及稀釋

利用紫外分光光度儀分別測定陽性質粒在260 nm和280 n m處的吸光度，只有A260／A280比值在1．7～1．9之間的質粒可以用于構建標準曲線。并計算出重組質粒的DNA純度、濃度和拷貝數(shù)。

1．2．3．1 標準陽性質粒濃度計算

將A260／A280比值在1．7～1．9之間的質粒，進行質粒濃度測定及拷貝數(shù)換算，根據(jù)公式：

質粒濃度（ng／μL）＝A260×50μg／mL×稀釋終體積（mL）×1000／稀釋時加入的原始溶液體積（μL）

1．2．3．2 標準陽性質粒拷貝數(shù)計算

計算出質粒的濃度，再根據(jù)公式：

質?？截悢?shù)（拷貝／μL）＝質粒濃度（ng／μL）×6．02×1014／660×堿基數(shù)（載體＋插入片段）

計算出質粒的拷貝數(shù)。

將重組質粒DNA進行10倍梯度稀釋制備不同拷貝數(shù)的標準陽性質粒模板，用于熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化和標準曲線的建立。

1．2．4 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

1．2．4．1 反應體系及優(yōu)化標準

反應體系為10μL：Pre Mix 5μL，正向引物0．45μL，反向引物0．45μL，Taq Man－MGB 0．25μL，模板2μL，實時熒光定量PCR反應條件：預變性95℃15 min，變性95℃15 s，延伸60℃1 min，40個循環(huán)，對熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化，以獲得較低的閾值（C t）和較高的熒光強度增加值（R n）。

1．2．4．2 引物濃度的優(yōu)化

對熒光定量PCR體系中的引物濃度進行優(yōu)化，分別做50、300、600、900 n m、1、10、20、30μm 引物濃度的優(yōu)化組合，優(yōu)化濃度時，探針濃度為20μm。

1．2．4．3 探針濃度優(yōu)化

上述確定最佳引物濃度后，固定引物濃度，探針濃度設置為600、900 n m、1、10、20、30μm。

1．2．4．4 退火溫度

退火溫度選擇在55～60℃范圍內以1℃作為梯度進行優(yōu)化。

1．2．5 重復性和敏感性試驗

1．2．5．1 重復性試驗

以質粒DNA為模板進行系列梯度稀釋，取3個濃度梯度進行熒光定量PCR檢測，各濃度重復測定3次，分析梯度內的C t值標準差和變異系數(shù)，評價方法的精密度。

1．2．5．2 敏感性試驗

將制備的陽性標準質粒DNA進行10倍倍比稀釋，作為PCR模板，進行熒光定量PCR檢測，檢驗建立方法的敏感性。

1．2．6 標準曲線的繪制

將上述制備標準陽性質粒10倍倍比稀釋后的標準品，實時熒光定量PCR擴增后，繪制標準曲線。

1．2．7 含有葡萄根瘤蚜的土壤DNA檢測

在0．25 g不含葡萄根瘤蚜的烘干土壤中加入10頭葡萄根瘤蚜若蟲，加入葡萄根瘤蚜若蟲的0．25 g非疫區(qū)土壤為陽性對照，0．25 g不含葡萄根瘤蚜的烘干土壤為陰性對照，參照Powersoil土壤DNA分離試劑盒操作說明，提取土壤DNA，并梯度稀釋，進行熒光定量PCR檢測。

1．2．8 田間土壤樣品檢測

取西安受葡萄根瘤蚜為害的深10 c m處的葡萄根際土壤，非疫區(qū)土壤為陰性對照，參照Powersoil土壤DNA分離試劑盒操作說明，提取土壤總DNA。以提取的土壤總DNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測。

1．3 結果分析方法

實時熒光定量PCR利用ABI 7500型熒光定量PCR儀自帶軟件SDS進行結果分析，根據(jù)陰性對照結果設定閾值線，擴增曲線及樣品C t值由軟件自動生成。

2 結果與分析

2．1 引物的驗證

以上海、湖南、西安3個地點采集的葡萄根瘤蚜提取的基因組DNA為模板，分別采用普通PCR和實時熒光定量PCR擴增目標片段ITS2基因，將PCR特異性擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段約為114 bp（圖1），實時定量PCR結果顯示為陽性，證明引物和探針適合我國的葡萄根瘤蚜。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2．2 ITS2目標基因PCR擴增、克隆及鑒定結果

以葡萄根瘤蚜提取的全基因組DNA為模板，擴增目標片段ITS2基因，將PCR特異性擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段約為114 bp，與預期的大小相一致，見圖2。

回收的PCR產(chǎn)物連接到p MD18－T質粒載體中，PCR鑒定為陽性的重組質粒進行序列測定，測序結果經(jīng)在Gen Bank數(shù)據(jù)庫上對比，與已發(fā)表的葡萄根瘤蚜的ITS2基因序列完全一致，結果表明重組質粒中含有葡萄根瘤蚜ITS2基因片段。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖

2．3 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

2．3．1 標準陽性模板濃度、拷貝數(shù)計算及稀釋

質粒經(jīng)100倍稀釋后，在260 n m和280 n m波長下A值的比值結果為A260／A280＝1．86，表明提取質粒純度較好，適合于熒光標準曲線的建立。

根據(jù)公式計算得到陽性質粒濃度為50 ng／μL，陽性質粒的拷貝數(shù)為1．625×1010拷貝／μL。

將重組質粒DNA進行10倍梯度稀釋，分別制備1．625×1010、1．625×109、1．625×108、1．625×107、1．625×106、1．625×105、1．625×104、1．625×103、1．625×102、1．625×101拷貝／μL和1．625拷貝／μL的標準陽性質粒模板，用于熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化，敏感性試驗和標準曲線的建立。

2．3．2 引物濃度的優(yōu)化

試驗結果表明，最優(yōu)引物濃度為10μm，見圖3。

圖3 實時熒光定量PCR引物濃度優(yōu)化

2．3．3 探針濃度的優(yōu)化

試驗結果表明，最優(yōu)探針濃度為10μm，見圖4。

圖4 實時熒光定量PCR探針濃度優(yōu)化

2．3．4 退火溫度的優(yōu)化

退火溫度選擇在55～60℃范圍內以1℃作為梯度進行優(yōu)化的平均C t分別為15．2、14．72、14．89、14．82、14．98和13．97，所以本試驗選擇60℃為最佳退火溫度。

2．4 重復性和敏感性試驗

2．4．1 重復性試驗

3次重復性測定1．625×105、1．625×103、1．625×101拷貝／μL高、中、低3個濃度的質粒DNA模板。得到各濃度梯度的C t值，并計算得各濃度的標準差及C t值變異系數(shù)見表3?？梢奀 t值的變異系數(shù)都小于5%，在誤差允許范圍內。說明建立的熒光定量PCR檢測方法對高、中、低不同濃度檢測結果重復性較好。

表2 實時熒光定量PCR重復性試驗

2．4．2 敏感性試驗

取1．625×103、1．625×102、1．625×101、1．625、1．625×10－1拷貝／μL和1．625×10－2拷貝／μL濃度梯度的標準模板進行實時熒光定量PCR擴增，擴增曲線當標準模板 DNA 濃度在1．625×103～1．625拷貝／μL范圍內時，擴增曲線的線形較好，很快達到平臺期，1．625×10－1拷貝／μL和1．625×10－2拷貝／μL擴增曲線與陰性對照相似所以判斷為陰性，此時的模板濃度已超出了檢測體系的檢測線性范圍，見圖5。因此，該方法穩(wěn)定的最低檢測靈敏度為1．625拷貝／μL。

圖5 實時熒光定量PCR靈敏度試驗

2．5 標準曲線的繪制

按上述優(yōu)化的反應條件，取1．625×104、1．625×105、1．625×106、1．625×107、1．625×108拷貝／μL的陽性質粒DNA作為模板，分別加入到PCR反應體系中進行擴增，系統(tǒng)自動分析軟件顯示C t值與標準陽性模板濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關系，標準曲線的斜率為－3．436，相關系數(shù)（R2）為0．99，擴增效率為95．462%（圖6）。試驗結果說明，根據(jù)C t值和標準曲線即可對樣品進行準確定量。

圖6 實時熒光定量PCR標準曲線

2．6 含有葡萄根瘤蚜的土壤DNA檢測

將提取的土壤DNA進行實時熒光定量PCR，所提取的DNA稀釋103倍后，仍能檢測出陽性結果。結果表明，采取熒光定量PCR的方法能夠檢測到土壤中葡萄根瘤蚜的存在，可以利用標準曲線對土壤中的葡萄根瘤蚜進行定性定量分析，見圖7。

2．7 田間土壤樣品檢測

試驗結果表明，利用上述引物可以在受葡萄根瘤蚜為害的葡萄根際土壤中檢測到葡萄根瘤蚜的存在，證明了實時熒光定量PCR檢測土壤中葡萄根瘤蚜的可行性，見圖8。

3 結論與討論

經(jīng)過實時熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化，初步應用Taq Man－MGB探針實時熒光定量PCR技術對含有葡萄根瘤蚜DNA的模板進行檢測，呈現(xiàn)良好的S型擴增曲線，能夠進行定量檢測，其靈敏度可達1．625拷貝／μL。本試驗驗證了實時熒光定量PCR用于檢測土壤中葡萄根瘤蚜的可行性，還進一步檢測了含有10頭葡萄根瘤蚜若蟲的土壤所提取的總DNA，并對所提DNA梯度稀釋，進行實時熒光定量PCR檢測，結果表明將所提取的DNA稀釋103倍，仍能檢測出陽性結果。在上述研究基礎之上，利用實時熒光定量PCR對受葡萄根瘤蚜為害的葡萄根際土壤進行了初步定性檢測，驗證了實時熒光定量PCR檢測土壤中葡萄根瘤蚜的可行性。利用該方法可以通過對土壤中葡萄根瘤蚜若蟲量進行檢測，從而達到對葡萄根瘤蚜種群動態(tài)監(jiān)測的目的，該方法避免了挖根調查對葡萄的傷害，也大幅降低了調查所需投入的人力物力，提高了準確度，給葡萄根瘤蚜疫情的檢測及監(jiān)測提供了較好的方法。但是，若想使田間所采集的土壤樣品能夠檢測到葡萄根瘤蚜并準確反映其種群動態(tài)變化，還需要對田間土壤采樣方法、土壤總DNA提取方法以及熒光定量PCR檢測結果與葡萄根瘤蚜種群量的對應關系進行深入研究。

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