蠟樣芽胞桿菌GXBC-3三個普魯蘭酶基因的表達及其酶學特性

李美蓉，汪小波，黃英，黃堅麗，梁甲元，黃日波,3，杜麗琴，韋宇拓

1 廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004

2 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004

3 廣西科學院，廣西 南寧 530004

普魯蘭酶 (Pullulanase) (EC3.2.1.41) 是能專一性分解普魯蘭糖 (Pullulan)、淀粉、支鏈淀粉和相應的低聚糖中側支分支點的 α-l,6糖苷鍵的一種異淀粉酶 (或稱枝切淀粉酶)，能使支鏈淀粉型多糖的分支鏈脫離主鏈形成一系列鏈長不一的直鏈淀粉[1]。而最近發(fā)現(xiàn)的新普魯蘭酶兼有糖苷水解酶和糖基轉移酶催化活性，能水解α-l,6-和α-l,4-糖苷鍵，是一種多功能水解淀粉酶[2]，將該酶與淀粉酶、糖化酶等配合使用，能加速淀粉充分糖化，提高淀粉質原料利用率、降低糧耗，在淀粉加工、制糖工業(yè)及啤酒和酒精生成行業(yè)中有著重要的用途和良好的市場前景。目前國內(nèi)普魯蘭酶研究僅限于實驗室，所篩選獲得的菌種的性能還遠不能滿足工業(yè)需求，國內(nèi)外工業(yè)用普魯蘭酶市場長期被國外大公司所壟斷，且價格昂貴，因此探索獲得優(yōu)良的新型普魯蘭酶基因，為實現(xiàn)普魯蘭酶國產(chǎn)化具有重要的意義。本研究從一株產(chǎn)中溫中性普魯蘭酶的菌株 Bacillus cereus GXBC-3 中克隆獲得了pulA、pulB和 pulC 3個普魯蘭酶基因，利用pSE380表達系統(tǒng)實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的表達，研究分析了重組酶的性質，為該酶下一步研究應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購自TaKaRa公司；金屬鎳親和層析介質購自Phamacia公司；麥芽糖、麥芽三糖為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株和質粒

蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus GXBC-3、宿主大腸桿菌Escherichia coli XL10-Gold 菌株和表達載體pSE380由本實驗室保藏。

1.2 方法

1.2.1 普魯蘭酶基因的克隆

根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的 Bacillus cereus假定的Ⅰ型和Ⅱ型普魯蘭酶基因序列，并進行了信號肽預測，設計引物 (表1)，以Bacillus cereus GXBC-3總DNA為模板，用Prime STAR HS DNA聚合酶進行PCR擴增目的基因，PCR退火溫度45 ℃，延伸2 min 40 s。

1.2.2 重組質粒的構建及目的蛋白的表達和純化

將目的基因連接到表達載體 pSE380上，經(jīng)測序驗證后，轉化到E. coliXL10-Gold進行IPTG誘導表達，收集菌體在冰浴條件下超聲波破胞，收集上清，使用金屬鎳親和層析法進行純化，利用 SDS-PAGE凝膠電泳來檢測純化效果。

1.2.3 酶活的測定

酶活性的測定采用 3,5-二硝基水楊酸(DNS) 試劑顯色法[3]，取500 μL不同濃度的葡萄糖溶液，加入500 μL DNS，沸水浴5 min。置于冰上冷卻至室溫后，稀釋3倍，測可見光OD520值來繪制葡萄糖標準曲線。酶活的測定完全依據(jù)制作葡萄糖標準曲線的方法進行。酶的活力單位定義為在最適溫度及最適pH條件下，按上述反應，每min生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位(1 U)。

1.2.4 重組酶含量及比活力測定

按照《蛋白質技術手冊》中的Bradford測定方法[4]來計算蛋白質濃度。根據(jù)國際酶學委員會規(guī)定比活力=活力U/mg蛋白。

1.2.5 HPLC分析條件

色譜柱：lltima Amino 100A 5u柱 (4.6 mm× 250 mm)；檢測器：Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器；流動相∶水相=65∶35；流速：1 mL/min；柱溫：28 ℃。

表1 普魯蘭基因引物序列Table 1 Primer sequences of pullulanase genes

2 結果與分析

2.1 普魯蘭酶基因的克隆

取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，泳道1、2、3分別為基因pulA (2 124 bp)、pulB (2 478 bp) 和pulC (2 484 bp)。在Signal IP和TMpred serve進行進行信號肽和疏水跨膜區(qū)預測，發(fā)現(xiàn)3個基因均無信號肽，為胞內(nèi)分泌表達。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析普魯蘭酶基因 PCR擴增產(chǎn)物Fig. 1 PCR product of pullulanases gene. M: W2003 DNA marker; 1: pulA; 2: pulB; 3: pulC.

2.2 普魯蘭酶基因的表達與純化

將構建好的基因工程菌按 2%接種量于 LB (含100 mg/L的Amp) 中，37 ℃搖瓶培養(yǎng)至菌體濃度 OD600約 0.6，用終濃度為 0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃搖床誘導表達10 h后，收集菌體、破胞、收集上清，用金屬鎳親和層析法純化目的蛋白，取 20 μL蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。結果如圖2所示，圖中泳道 3、5、7分別表示為純化重組普魯蘭酶PulA、PulB和 PulC，其蛋白表達量和相對分子量見表2。

2.3 重組酶酶學性質研究

2.3.1 重組酶底物特異性分析

用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制1%濃度的不同底物溶液與重組酶反應，測繪底物-相對酶活力的曲線，分析重組酶底物特異性。比較重組酶PulA、PulB和PulC對不同底物相對水解速度，可得3種酶的最適底物均為普魯蘭糖，經(jīng)HPLC分析只產(chǎn)生麥芽三糖；重組酶PulA還可水解可溶性淀粉產(chǎn)生麥芽糖和麥芽三糖的混合物；而重組酶PulB和PulC不水解可溶性淀粉。綜上可得，重組酶PulA能水解α-l,6-和α-l,4-糖苷鍵，為Ⅱ型普魯蘭酶；重組酶PulB和PulC只水解α-l,6-糖苷鍵，為Ⅰ型普魯蘭酶。

圖2 純化后的重組普魯蘭酶SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified reconbinant pullulanases. M: standard protein maker; 1: reconbinant E. coli XL10-Goldcontaining pSE380; 2: reconbinant E. coli XL10-Gold containing pSE380-pulA; 3: recombinant pullulanase PulA purified on nickel column; 4: reconbinant E. coli XL10-Gold containing pSE380-pulB; 5: recombinant pullulanase PulB purified on nickel column; 6: reconbinant E. coli XL10-Gold containing pSE380-pulC; 7: recombinant pullulanase PulC purified on nickel column.

2.3.2 重組酶最適溫度及熱穩(wěn)定性

取50 μL稀釋酶液與450 μL 1%普魯蘭糖/可溶性淀粉溶液在15 ℃~70 ℃下每隔5 ℃反應10 min后測定酶活，以酶活最高者作為100%，繪制溫度-酶活力的影響曲線。重組酶PulA的普魯蘭酶和淀粉酶 (Amy A) 最適溫度分別為40 ℃、50 ℃，重組普魯蘭酶PulB和PulC的最適溫度均為45 ℃ (圖3)。

圖3 重組酶的最適溫度Fig. 3 Optimal temperature of recombinant enzymes.

在各溫度梯度下，將稀釋酶液分別保溫處理30 min，于最適溫度下反應10 min后測定殘余酶活力，以未保溫處理的酶活為100%，繪制溫度-相對殘余酶活力曲線。低于40 ℃時，3種重組酶相對殘余活力均高于80%，熱穩(wěn)定性較好；高于40 ℃時，3種重組酶相對殘余活力均急劇下降，熱穩(wěn)定性差 (圖4)。

2.3.3 重組酶最適pH及pH穩(wěn)定性

取50 μL稀釋酶液與450 μL 1%的普魯蘭糖/可溶性淀粉溶液在pH 4.5~9.0內(nèi)，每隔0.5個梯度，于最適溫度反應10 min后測定酶活，以酶活最高者作為100%，繪制pH-酶活力的影響曲線。重組酶 PulA的普魯蘭酶和淀粉酶 (AmyA)最適pH分別為6.5、7.0，重組酶PulB和PulC的普魯蘭酶最適pH分別為7.0、6.5 (圖5)。

用不同pH緩沖液稀釋純化重組酶，于4 ℃處理4 h，于最適條件下反應測定殘余酶活力，以未經(jīng)酸處理的酶活為100%，繪制pH-相對殘余酶活力曲線。3種重組酶在pH 5.5~8.0范圍內(nèi)相對殘余活力較高，pH穩(wěn)定性較好，其中適度的pH條件對PulC有較弱激活作用 (圖6)。

圖4 重組酶的熱穩(wěn)定性Fig. 4 Thermal stability of recombinant enzymes.

圖5 重組酶的最適pHFig. 5 Optimal pH of recombinant enzymes.

2.3.4 Ca2+對重組酶熱穩(wěn)定性的影響

將Ca2+終濃度分別為0~10 mmol/L的稀釋酶液液于4 ℃處理12 h，于40 ℃保溫30 min，在最適條件下反應后測繪 Ca2+濃度-相對酶活力曲線。在2~10 mmol/L范圍內(nèi)，Ca2+對重組酶PulA、PulC普魯蘭酶熱穩(wěn)定性有較明顯抑制作用；在0~10 mmol/L范圍內(nèi)，Ca2+對重組酶PulA淀粉酶(AmyA) 與 PulB普魯蘭酶熱穩(wěn)定性有較明顯激活作用，且分別在2、4 mmol/L時激活作用最強(圖7)。

圖7 Ca2+對重組酶熱穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of Ca2+ on thermal stability of recombinant enzymes.

2.3.5 EDTA對重組酶活性的影響

將EDTA終濃度分別為0~500 mmol/L的稀釋酶液于4 ℃處理12 h，在最適條件下與底物反應后分別測繪EDTA濃度-相對酶活力曲線。在10~40 mmol/L內(nèi)對重組酶PulA普魯蘭酶活性有較顯著激活作用，且激活作用隨EDTA濃度增大而減弱；在50~500 mmol/L內(nèi)對重組酶PulA普魯蘭酶活性有較顯著抑制作用，且抑制作用隨其濃度增大而增強。在50~500 mmol/L內(nèi)對重組酶PulB普魯蘭酶活性有較顯著抑制作用，且抑制作用隨其濃度增大而增強。在10~500 mmol/L內(nèi)對重組酶 PulB普魯蘭酶活性有顯著抑制作用，且抑制作用隨濃度增大而增強。在10~500 mmol/L內(nèi)對重組酶PulA淀粉酶 (AmyA) 活性有較顯著抑制作用，且其抑制作用隨濃度增大無明顯改變(圖8)。

2.3.6 金屬離子對重組酶活性的影響

用終濃度為2 mmol/L的不同金屬氯化物稀釋酶液，于4 ℃處理12 h，在最適條件下與底物反應后分別測繪金屬離子-相對酶活力曲線。Mg2+、Mn2+對重組酶PulA普魯蘭酶活性有顯著激活作用，而Cu2+、Zn2+、Fe2+對其有顯著抑制作用；Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+對重組酶PulB普魯蘭酶活性有顯著激活作用，而 Fe2+對其有顯著抑制作用；Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+對重組酶 PulC普魯蘭酶活性有顯著激活作用，而Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+對其有顯著抑制作用；Ca2+、Mg2+、Ba2+、 Fe3+對重組酶PulA淀粉酶(AmyA) 活性有顯著激活作用，而Zn2+對其有微弱抑制作用 (圖9)。

圖8 EDTA對重組酶活性的影響Fig. 8 Effect of EDTA on recombinant enzyme activities.

圖9 金屬離子對重組酶活性的影響Fig. 9 Effect of metal ions on recombinant enzyme activities.

2.4 重組酶比活力及Km、Vmax測定

按照1.2.4方法測定各重組酶比活力。在最適條件下取不同濃度的普魯蘭糖/可溶性淀粉[S]，測得反應速度V，計算出1/V與1/[S]，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求得各重組酶對普魯蘭糖/可溶性淀粉的Km值和Vmax，結果見表2。

3 討論

普魯蘭酶根據(jù)對底物的特異性一般可分為Ⅰ型和Ⅱ型普魯蘭酶，Ⅰ型普魯蘭酶又稱脫支酶，特異性水解α-1,6-糖苷鍵，形成麥芽三糖和線性的以α-1,4-糖苷鍵連接的多聚物；Ⅱ型普魯蘭酶又稱amylo-pullulanse，既能水解α-1,6-糖苷鍵，又能水解α-1,4-糖苷鍵。不同來源的普魯蘭酶的分子量有很大差異，從76~150 kDa不等；但它們都含有幾個保守區(qū)，包括細菌普魯蘭酶相關區(qū)域、普魯蘭酶N-端區(qū)域及α-淀粉酶亞家族等，使之形成特定的空間結構以行使其水解功能[5]。本研究首次實現(xiàn)了在同一株Bacillus cereus GXBC-3中克隆并成功表達了3個、兩種不同類型的普魯蘭酶基因pulA、pulB和pulC。其中pulA為Ⅱ型普魯蘭酶基因，其表達的酶PulA能同時水解α-l,6-和α-l,4-糖苷鍵，它可能與來源于環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans F-2的Ⅱ型普魯蘭酶相似，其酶中心結構域含兩個不同活性位點[6]。pulB和pulC為Ⅰ型普魯蘭酶基因，其表達的酶PulB和PulC只水解α-l,6-糖苷鍵。目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)普魯蘭酶比活力較低，如比較來源其他Bacillus cereus的普魯蘭酶性質見表3[7-9]，這些普魯蘭酶活力較低；其他如來源環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans F-2[6]、 嗜 堿 芽 胞 桿 菌alkalophilic Bacillus sp. KSM-1378[10]和嗜熱芽胞桿菌thermophilic Bacillus sp. AN-7[11]的Ⅱ型普魯蘭酶比活力分別為133.6 U/mg、83.1 U/mg和151.5 U/mg。而本研究中Ⅱ型普魯蘭酶 PulB和PulC的比活力均接近230 U/mg，明顯優(yōu)于其他同類研究中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型普魯蘭酶。

將3個普魯蘭酶在SMART serve進行功能結構域預測分析，發(fā)現(xiàn)其均隸屬于淀粉酶13家族 (GH 13) 普魯蘭酶亞科，除含中心結構域Aamy外，均含一具脫枝功能的N端結構域pfmCBM-48；而普魯蘭酶PulB和PulC還含一普魯蘭糖-蛋白互作N端結構域Pfm PUD，具有普魯蘭糖綁定功能，與底物特異性有關。Martin Machovi?和?tefan Jane?ek研究表明，最近新建立的GH13普魯蘭酶亞科CBMs家族同時具有α-淀粉酶、普魯蘭酶活性，或單具普魯蘭酶活性；而且所有這些酶均是多域蛋白質，至少具有一個代表酶的特異性的結構域[12]。推測在具有Aamy和pfm CBM-48而無pfm PUD時，普魯蘭酶不單只與普魯蘭糖綁定，水解 α-l,6-糖苷鍵；還可作用于可溶性淀粉，水解 α-l,4-糖苷鍵。而在同時具有Aamy、pfm CB M-48和pfm PUD時，普魯蘭酶只與普魯蘭糖綁定，水解α-l,6-糖苷鍵。另外普魯蘭酶 PulC還含有一個與酶熱穩(wěn)定性有關的C端結構域pfm Alpha-amyC。Kim等刪除來源植物乳桿菌 Lacto-bacillus plantarum L137的amylo-pullulanase的結構域C，酶活力雖然減弱，但pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和對底物親和力都明顯增強[13]。而Lin等發(fā)現(xiàn)把來源嗜熱厭氧乙醇桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus 39E的普魯蘭酶C-端的100個氨基酸殘基刪除，酶的空間結構和酶活性沒有變化[14]。所以不同普魯蘭酶的C端結構域的功能還不能確定，需要進一步研究。

表2 重組酶活力測定Table 2 Activities of recombinant enzymes

表3 其他Bacillus cereus的普魯蘭酶性質Table 3 Pullulanase properties from other Bacillus cereus

相信隨著更多的Ⅰ、Ⅱ型普魯蘭酶的發(fā)現(xiàn)[15-16]，和其分子結構和結構域功能的深入研究，就可以通過表達系統(tǒng)的優(yōu)化和對普魯蘭酶進行分子改造，提高酶表達量，增強酶活力，改造酶的底物特異性和溫度、pH耐受性，使酶學特性更適合工業(yè)應用。

[1] Saha B C, Zeikus J G. Novel highly thermostable pullulanase from thermophiles. Trends Biotechnol, 1989, 7(9): 234?239.

[2] Takata H, Kuriki T, Okada S, et al. Action of neopullulanase catalyzes both hydrolysis and transglycosylation at alpha-(1,4)-and alpha-(1,6)-glucosidic linkages. J Biol Chem, 1992, 267(26): 18447?18452.

[3] Yang H, Wang ZH, Pang KC, et al. Study on amylase activity of Bacillus spp. Mod Agri Sci Technol, 2007(2): 90–93.楊慧, 王振華, 潘康成, 等. 芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的研究. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2007(2): 90?93.

[4] Wang JZ, Fang M. Handbook of Protein Technology. Beijing: Science Press, 2000: 42?47.汪家政, 范明. 蛋白質技術手冊. 北京: 科學出版社, 2000: 42?47.

[5] Marchler-Bauer A, Anderson JB, Chitsaz F, et al. CDD: specific functional annotation with the Conserved Domain Database. Nucleic Acids Res, 2009, 37: D205?D210.

[6] Kim CH , Kim YS. Substrate specificity and detailed characterization of a bifunctional amylase-pullulanase enzyme from Bacillus circulans F-2 having two different active sites on one polypeptide. Eur J Biochem, 1995, 227(3): 687?693.

[7] Nair SU, Singhal RS, Kamat MY. Induction of pullulanase production in Bacillus cereus FDTA-13. Bioresour Technol, 2007, 98(4): 856?859.

[8] Ling HS, Ling TC, Mohamad R, et al. Characterization of pullulanase type Ⅱ from Bacillus cereus H1.5. Am J Biochem Biotechl, 2009, 5(4): 170?179.

[9] Bakshi A, Patnaik PR, Gupta JK. Thermostable pullulanase from a mesophilic Bacillus cereus isolate and its mutant UV7.4. Biotechl Lett, 1992, 14(8): 689?694.

[10] Ara, K, Saeki K, Igarashi K, et al. Purification and characterization of an alkaline amylo-pullulanase with both α-1, 4 and α-1, 6 hydrolytic activity from alkalophilic Bacillus sp. KSM-1378. Biochim Biophys Acta, 1995, 1243(3): 315?324.

[11] Kunamneni A, Singh S. Improved high thermal stability of pullulanase from a newly isolated thermophilic Bacillus sp. AN-7. Enzyme Microb Technol, 2006, 39(7): 1399?1404.

[12] Machovi? M, Jane?ek S. Domain evolution in the GH13 pullulanase subfamily with focus on the carbohydrate-binding module family 48. Biologia, 2008, 63(6): 1057?1068.

[13] Kim JH, Sunako M, Ono H, et al. Characterization of the C-terminal truncated form of amylopullulanase from Lactobacillus plantarum L137. J Biosci Bioeng, 2009, 107(2): 124?129.

[14] Lin HY, Chuang HH, Lin FP. Biochemical characterization of engineered amylopullulanasefrom Thermoanaerobacter ethanolicus 39E-implicating the nonnecessity of its 100 C-terminal amino acid residues. Extremophiles, 2008, 12(5): 641?650.

[15] Ara K, Saeki K, Igarashi K, et al. Purification and characterization of an alkaline amylo-pullulanase with both α-1, 4 and α-1, 6 hydrolytic activity from alkalophilic Bacillus sp. KSM?1378. Biochim Biophy Acta, 1995, 12434(3): 315?324.

[16] Jiao Y L, Wang S J, Lji M S, et al. A GH57 family amylopullulanase from deep-sea Thermococcus siculi: expression of the gene and characterization of the recombinant enzyme. Curr Microbiol, 2011, 62(1): 222?228.