苦參愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)條件研究

劉 瑤， 齊香君， 李 雅， 李 軍

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021; 2.中國(guó)藥科大學(xué) 國(guó)際醫(yī)藥商學(xué)院，江蘇 南京 211198)

0 引言

中藥苦參(SophoraflavescensAit.)為豆科槐屬落葉灌木植物，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功能.苦參中的苦參堿和氧化苦參堿具有良好的抗癌活性，對(duì)黑膀胱癌、色素瘤、胃癌等均有抑制作用[1].目前以苦參和其有效成分為原料開發(fā)了多種制劑并廣泛用于臨床[2].隨著苦參制劑的開發(fā)，苦參藥材的市場(chǎng)需求量在不斷增加，2011年苦參市場(chǎng)價(jià)14元左右，在近幾年內(nèi)翻了4倍多.本研究旨在從中藥資源可持續(xù)性發(fā)展考慮，對(duì)苦參愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，為藥用植物苦參資源的可持續(xù)發(fā)展探索新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

苦參種子購(gòu)買于河北安國(guó)藥材市場(chǎng)；乙腈(分析純)、無(wú)水乙醇(分析純)購(gòu)于天津市紅巖化學(xué)試劑廠；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)植物激素均購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心.MS培養(yǎng)基：Murashige and Skoog(1962)培養(yǎng)基.

1.1.2儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：安捷倫高效液相色譜儀；培養(yǎng)箱：LRH-250-GSI智能人工氣候箱.

1.2 方法

1.2.1苦參外植體制備

選顆粒飽滿苦參種子，直接種植土壤中，室溫發(fā)芽；或?qū)⒎N子做常規(guī)消毒處理[3]后接于MS培養(yǎng)基種，25±1℃，黑暗條件下發(fā)芽，培養(yǎng)一周左右后獲得苦參幼芽；光照條件下繼續(xù)生長(zhǎng)兩星期獲得苦參幼苗.

1.2.2不同外植體對(duì)苦參愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為了考察苦參愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體，分別取苦參幼苗葉片、根、莖和苦參幼芽為外植體，葉片切成0.5～1.0cm2大小的方塊，根、莖和幼芽切成1.0～1.5cm小段，接種于MS+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA培養(yǎng)基中，25±1℃，暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng).

1.2.3植物激素組合對(duì)苦參愈傷組織誘導(dǎo)的影響

激素組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率、顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)狀態(tài)等影響較大.本研究以苦參幼芽為外植體，將其接種于不同植物激素組合的MS固體培養(yǎng)基上，25±1℃，黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察不同激素組合下苦參愈傷組織誘導(dǎo)情況.

1.2.4苦參愈傷組織增殖繼代培養(yǎng)研究

為了考察苦參愈傷組織增殖的最佳激素組合，以苦參愈傷組織生物量的增殖率為測(cè)定指標(biāo)，將誘導(dǎo)出的顏色、質(zhì)地、形態(tài)都相似的愈傷組織，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，25±1℃，黑暗條件下考察不同激素組合對(duì)苦參愈傷組織生長(zhǎng)的影響，每組設(shè)3個(gè)平行(n=3).

1.2.5愈傷組織中苦參堿及氧化苦參堿的檢測(cè)

HPLC檢測(cè)苦參堿(MT)及氧化苦參堿(OMT)的色譜條件：色譜柱：氨基柱(Hypersil NH24.6mm×250mm，5μm，柱號(hào)：E2021505，批號(hào)：9347)；流動(dòng)相：乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸(84∶8∶8)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：15μL；柱溫：室溫.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)苦參愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以苦參幼芽、幼苗的根、莖段、葉片為外植體，在MS+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA培養(yǎng)基中，25±1℃，暗條件下苦參愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為94.12%、74.19%、35.71%、23.08%.幼芽為其誘導(dǎo)的最佳外植體.以幼芽為外植體其愈傷組織的誘導(dǎo)率最高.誘導(dǎo)過程中，苦參幼芽在培養(yǎng)基上接種7d后，傷口開始膨大，待誘導(dǎo)至10d左右，傷口的膨大部位逐漸長(zhǎng)出淡黃色的愈傷組織(如圖1所示)，繼續(xù)培養(yǎng)，愈傷組織逐漸長(zhǎng)大.

圖1 以幼芽為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織

2.2 植物激素組合對(duì)苦參愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同植物激素對(duì)苦參愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果如表1所示.

表1 激素組合對(duì)苦參愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1中可以看出，不同植物激素組合均能誘導(dǎo)出愈傷組織.在MS+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA組合下其誘導(dǎo)率最高，為94.12%.在不同激素組合下，苦參愈傷組織形態(tài)沒有明顯差異，呈淡黃色，質(zhì)地松軟.

2.3 愈傷組織的繼代培養(yǎng)研究

不同植物激素組合下苦參愈傷組織的繼代增殖結(jié)果如表2所示.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由直觀分析可以看出，苦參愈傷組織增殖率的最優(yōu)激素組合為A2B1C2，其增殖率為23.8%.所選3個(gè)因素對(duì)苦參愈傷組織增殖率影響的強(qiáng)弱順序?yàn)镃>A>B；其增殖的最佳激素組合為A2B2C2，組合不在正交表試驗(yàn)里，需做驗(yàn)證性試驗(yàn).由試驗(yàn)結(jié)果看，A2B2C2組合下愈傷組織的增殖率為25.3%(大于23.8%)，顏色透亮，呈淡黃色，質(zhì)地松軟，生長(zhǎng)較快(如圖2所示).

表3 方差分析結(jié)果

注：F0.95(2,2)=19.

由方差分析結(jié)果(如表3所示)可以看出：因子C(NAA)在α=0.05水平上對(duì)苦參愈傷組織增殖具有顯著性影響.

圖2 愈傷組織增殖前后對(duì)比

2.4 愈傷組織中苦參堿及氧化苦參堿的檢測(cè)

本研究采用HPLC法對(duì)苦參愈傷組織中苦參堿及氧化苦參堿進(jìn)行定量分析，其苦參堿(MT)及氧化苦參堿(OMT)的積累情況如表4所示.

表4 愈傷組織中苦參堿及氧化苦參堿的含量

由結(jié)果可知，苦參愈傷組織中氧化苦參堿的含量較高，苦參堿及氧化苦參堿的總含量為4.74%，是《中華人民共和國(guó)藥典》2010版[4]中規(guī)定二者含量不低于1.2%的3.95倍.這可能與誘導(dǎo)苦參愈傷組織的外植體(幼芽)有關(guān)系，由檢測(cè)結(jié)果可知，幼芽中氧化苦參堿的含量較高，使得愈傷組織中氧化苦參堿的含量也處于較高水平.

3 結(jié)束語(yǔ)

(1)不同外植體下，苦參愈傷組織誘導(dǎo)率不同.以苦參幼芽、幼苗的根、莖段、葉片為外植體，其愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為94.12%、74.19%、35.71%、23.08%.幼芽為其誘導(dǎo)的最佳外植體.

(2)苦參愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/LNAA，25±1℃，黑暗條件；增殖培養(yǎng)基的最佳激素組合：MS+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA，25±1℃，黑暗條件；此條件下其增殖率為25.3%.

(3)苦參愈傷組織中苦參堿及氧化苦參堿的總含量為4.74%.

[1] 何 雄，韋星船，田裕昌，等．苦參堿及其衍生物合成及生物活性研究進(jìn)展[J]．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28(9)：816-823.

[2] 張鳳玲，唐 永，張景梅．苦參堿、氧化苦參堿的藥理作用及其制劑的研究進(jìn)展[J]．河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004(3)：84-86.

[3] 齊香君，陳秀清，何恩銘.發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)黃芩毛狀根的研究[J]．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(5)：244-247.

[4] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.