阿托伐他汀對(duì)氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪細(xì)胞分泌功能的影響

謝湘竹，趙水平，于碧蓮，鐘巧青

目前認(rèn)為，炎性反應(yīng)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［1］。脂肪細(xì)胞和脂肪組織不僅參與脂質(zhì)和能量代謝，而且還參與了炎性反應(yīng)，兩者在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的作用極其重要。氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)具有致動(dòng)脈粥樣硬化作用，還在局部慢性炎性反應(yīng)中起一定的作用［2］。他汀類藥物具有獨(dú)立于降膽固醇以外的多效性作用［3-5］。本文旨在研究阿托伐他汀對(duì)oxLDL刺激狀態(tài)下脂肪細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、oxLDL購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，阿托伐他汀原粉由北京紅惠制藥公司饋贈(zèng)，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，核因子-κB(NF-κB)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Active Motif公司。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與鑒定:根據(jù)3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化方案［6］，用完全培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后2 d(第0天)時(shí)開始誘導(dǎo)分化，將培養(yǎng)液換成含0．5 mmol/L IBMX、0．25 μmol/L 地塞米松和10 mg/L胰島素的完全促分化液。48 h后，撤去IBMX和地塞米松，換成只含有10 mg/L胰島素的促分化液，2 d換液1次。至第9天，＞95%的3T3-L1細(xì)胞分化成為成熟脂肪細(xì)胞，經(jīng)油紅O染色法鑒定，顯微鏡下脂肪細(xì)胞中脂滴呈亮紅色。

1.2.2 藥物干預(yù):脂肪細(xì)胞分化成熟后，用含0．2%去脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓療法24 h后，分別用不同濃度阿托伐他汀(0、0．1、1．0、10．0 μM)干預(yù)，18 h 后，再加入含50 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基孵育1 h。提取培養(yǎng)上清液及細(xì)胞，－70℃凍存?zhèn)溆谩ｐ囸I療法后未予任何干預(yù)的脂肪細(xì)胞為空白對(duì)照組。

1.2.3 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度測(cè)定:使用小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，按說(shuō)明測(cè)定脂肪細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的濃度。

1.2.4 TNF-α及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)mRNA表達(dá)水平的測(cè)定:用TRIzol一步法提取總RNA，應(yīng)用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)法檢測(cè) TNF-α及 PPAR-γmRNA表達(dá)水平。TNF-α引物序列為:上游 5'-GCCACCACGCTCTTCTG-3'，下游 5'-GGTGTGGGTGAGGAGCA-3'，產(chǎn)物342 bp;PPAR-γ引物序列為:上游5'-TGGAGCCTAAGTTTGAGTTTGC-3'，下游為 5'-TGACGATCTGCCTGAGGTCTG-3'，產(chǎn)物249 bp;內(nèi)參GAPDH引物序列為:上游 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn) 物 439 bp。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性50 s，50℃(TNF-α)、56℃(PPAR-γ)、58℃(GAPDH)退火1 min，72℃ 延伸 1 min，循環(huán) 36 次，72℃ 終末延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳成像后，分析各組目的基因及GAPDH基因灰度值，以兩者的比值代表TNF-α和PPAR-γmRNA的表達(dá)水平。

1.2.5 核蛋白提取及NF-κB活性檢測(cè):使用細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，BCA法定量，－70℃保存?zhèn)溆?，ELISA檢測(cè)NF-κB活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主要統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本間比較采用Oneway ANOVA檢驗(yàn)，LSD方法進(jìn)行。主要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α濃度 oxLDL刺激使3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌TNF-α增加，而阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制oxLDL刺激下脂肪細(xì)胞 TNF-α的分泌。50μg/ml oxLDL刺激下 TNF-α的分泌水平為(8．93±3．26)pg/ml，在0．1、1．0、10．0 μM 阿托伐他汀的干預(yù)下，oxLDL刺激下脂肪細(xì)胞TNF-α的分泌水平分別為(6．72 ±2．59)pg/ml，(4．68 ±1．31)pg/ml，(4．09 ±1．42)pg/ml。與 oxLDL 刺激組比較，1．0及10．0 μM阿托伐他汀干預(yù)組TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。10．0與0．1 μM 阿托伐他汀干預(yù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見圖1。

圖1 不同濃度阿托伐他汀對(duì)TNF-α分泌的影響

2.2 TNF-αmRNA表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，50μg/ml oxLDL刺激使 3T3-L1脂肪細(xì)胞 TNF-α mRNA 表達(dá)水平增高2．9 倍(0．633 ±0．157 vs0．218 ±0．078，P ＜0．001)。阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制oxLDL刺激下脂肪細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)，與ox-LDL刺激組比較，1．0和10．0μM阿托伐他汀的干預(yù)分別使脂肪細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá)降低48．8%和56．5%(0．324 ± 0．098 vs 0．633 ± 0．157;0．275 ±0．097 vs 0．633 ±0．157，P ＜0．05)。10．0 與0．1 μM阿托伐他汀干預(yù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0．275±0．097 vs 0．502 ± 0．157，P ＜0．05)。見圖2。

圖2 不同濃度阿托伐他汀對(duì)TNF-αmRNA表達(dá)水平的影響

2.3 NF-κB活性 與空白對(duì)照組比較，50μg/ml oxLDL 刺激使NF-κB 活性增加1．65 倍(4．08 ±0．87 vs 1．54±0．44，P ＜0．05)。阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制 oxLDL 刺激下 NF-κB 的活性。0．1、1．0 及10．0μM阿托伐他汀干預(yù)后，NF-κB活性分別為3．69± 0．79、2．93 ± 0．62 和 2．39 ± 0．51，其中10．0μM阿托伐他汀的干預(yù)使 NF-κB活性降低41．2%，與oxLDL刺激組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。10．0與0．1 μM 阿托伐他汀干預(yù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見圖3。

圖3 不同濃度阿托伐他汀對(duì)NF-κB活性的影響

2.4 PPAR-γmRNA表達(dá) PPAR-γmRNA在分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞有較高水平的表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，oxLDL刺激1 h PPAR-γmRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P＞0．05)。與oxLDL刺激組比較，0．1及1．0 μM 阿托伐他汀干預(yù)后 PPAR-γ mRNA 表達(dá)輕度升高(1．51 ±0．64 vs 1．03 ±0．44，2．23 ±0．69 vs 1．03 ±0．44，P ＞0．05)，而 10．0 μM阿托伐他汀的干預(yù)使PPAR-γmRNA的表達(dá)增加2．83倍(2．92 ± 0．96 vs 1．03 ± 0．44，P ＜ 0．001)。10．0與0．1μM阿托伐他汀干預(yù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見圖4。

圖4 不同濃度阿托伐他汀對(duì)PPAR-γmRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎性疾?。?］。脂肪組織是低水平慢性炎性狀態(tài)的重要決定因素［8-9］，可能與肥胖及其并發(fā)癥的進(jìn)展有關(guān)［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥兔脂肪細(xì)胞TNF-α的分泌水平及皮下脂肪組織TNF-αmRNA的表達(dá)水平均明顯增高［12-13］，且體外使用脂多糖(LPS)刺激脂肪細(xì)胞后其分泌的TNF-α水平亦明顯增高［14］。目前研究發(fā)現(xiàn)，LDL及ox-LDL均能明顯刺激人單核/巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)［13，15］，具有明顯的促炎效應(yīng)。本研究結(jié)果提示，oxLDL刺激也能造成脂肪細(xì)胞的體外炎性狀態(tài)。阿托伐他汀的抗炎效應(yīng)已經(jīng)得到肯定，并且認(rèn)為，阿托伐他汀的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用與其抗炎效應(yīng)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制ox-LDL刺激下脂肪細(xì)胞TNF-α的分泌及表達(dá)。

阿托伐他汀抑制脂肪細(xì)胞分泌TNF-α的確切分子機(jī)制目前仍不十分清楚。大量研究顯示，他汀類的抗炎作用并不依賴于其對(duì)膽固醇水平的降低［3-5］。已有研究表明，阿托伐他汀及普伐他汀均能激活人單核細(xì)胞 PPAR-γ，抑制 NF-κB 活性，減少 TNF-α 的分泌［16-17］，本研究觀察了阿托伐他汀對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)及NF-κB活性的直接影響，結(jié)果與報(bào)道一致。提示PPAR-γ與NF-κB等可能介導(dǎo)了他汀類藥物對(duì)單核細(xì)胞炎性過(guò)程的調(diào)節(jié)。

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