恒化培養(yǎng)稀釋率和碳氮比對圓紅冬孢酵母油脂積累的影響

沈宏偉，靳國杰，胡翠敏，龔志偉，白鳳武，趙宗保,3

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023

2 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023

3 大連潔凈能源國家實驗室 (籌)，遼寧 大連 116023

能源短缺和環(huán)境污染給當(dāng)今社會可持續(xù)發(fā)展帶來雙重壓力。一些研究者認為可再生、環(huán)境友好的燃料在近期內(nèi)最有可能取代化石燃料而緩解這個問題[1-2]。生物柴油與化石柴油性質(zhì)相近，但燃燒排放的污染氣體遠低于化石柴油[3]。生物柴油所用原料主要來源于植物油脂、動物脂肪和廢棄油脂，明顯受時間、地點以及季節(jié)等條件影響，很難滿足生物柴油規(guī)模化生產(chǎn)需求。微生物油脂主要指通過酵母、細菌和霉菌等微生物將碳水化合物或碳氫化合物轉(zhuǎn)化成的甘油酯，其脂肪酸成分和植物油相似。由于微生物油脂生產(chǎn)可有計劃地實施，已成為潛在的油脂獲取新路線[4]。

針對微生物油脂，國內(nèi)外學(xué)者做了大量研究工作。通過研究油脂合成發(fā)現(xiàn)有機氮源能夠提高某些產(chǎn)油微生物胞內(nèi)的油脂含量[5-6]，在限制硫源[7]或磷源[8]條件下也能夠促進油脂積累。為了拓展油脂發(fā)酵底物來源，甘油[9-10]、淀粉[11]、淀粉廢水[12]、菊芋[13]、糖蜜[14]和污水[15]等被用來轉(zhuǎn)化合成油脂。在油脂發(fā)酵方式中，進行了批式發(fā)酵[16]、批式補料發(fā)酵[17-18]、連續(xù)發(fā)酵[19]和部分菌體循環(huán)的連續(xù)發(fā)酵[20]研究。

在一些產(chǎn)油微生物連續(xù)培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)：稀釋率下降，胞內(nèi)油脂含量和細胞干重增加[21]，稀釋率減小有助于油脂生產(chǎn)，但稀釋率過低對油脂生產(chǎn)不利[22]。胞內(nèi)油脂含量隨著碳氮比增大而增加，油脂脂肪酸成分不受碳氮比影響，但脂肪酸相對含量有所變化[14,23]。圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.138 9油脂含量高，生長速度快。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的碳氮比為 420時，胞內(nèi)油脂含量可達 76%，但在培養(yǎng)120 h后，生物量僅為10.7 g/L[24]。在兩階段培養(yǎng)中，將第一階段增殖的圓紅冬孢酵母回收后，在第二階段重懸于葡萄糖培養(yǎng)液中可實現(xiàn)油脂快速積累[25]。目前，關(guān)于圓紅冬孢酵母連續(xù)培養(yǎng)未見報道。本文采用恒化培養(yǎng)方式，考察在穩(wěn)態(tài)條件下稀釋率和碳氮比對圓紅冬孢酵母油脂積累的影響。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

圓紅冬孢酵母菌 Rhodosporidium toruloides AS 2.138 9購自中國普通微生物菌種保藏管理中心 (CGMCC)

1.2 培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，培養(yǎng)基初始pH值用1 mol/L NaOH調(diào)至6.0。固體培養(yǎng)基在YEPD液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入15 g/L瓊脂粉。

批式發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 100，酵母粉5，硫酸銨5，七水硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀0.5。

恒化培養(yǎng)基1 (g/L)：葡萄糖70，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉0.75，硫酸銨0.1，pH 5.6。

恒化培養(yǎng)基2 (g/L)：葡萄糖40，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉0.75，硫酸銨0.1，pH 5.6。

1.3 培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng)：將新鮮斜面圓紅冬孢酵母接種于50 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，取20 mL轉(zhuǎn)接到180 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。

批式培養(yǎng)：將培養(yǎng)24 h的種子接種到3 L發(fā)酵罐 (上海保興 3-BG) 中，接種量為 10%，接種后體積為2 L。培養(yǎng)溫度30 ℃，pH通過自動流加1.5 mol/L NaOH控制在5.6，通氣量50 L/h，發(fā)酵時通過溶解氧與攪拌聯(lián)動控制溶解氧在45%左右。

恒化培養(yǎng)：批式發(fā)酵至35 h時，蠕動泵補加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，開始恒化培養(yǎng)，恒化培養(yǎng)工作體積為1.55 L。間隔一定時間取樣，測量殘?zhí)呛亢蚈D600，當(dāng)殘?zhí)呛蚈D600基本不變時培養(yǎng)進入穩(wěn)態(tài)。當(dāng)改變培養(yǎng)條件 (稀釋率或碳氮比) 后，連續(xù)流加5個工作體積培養(yǎng)基，然后開始取樣，每間隔3 h取1次，共取3次，分析生物量和殘?zhí)?，基本恒定時確定為穩(wěn)態(tài)。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

發(fā)酵液離心去掉上清液，收集沉淀，加入蒸餾水離心洗滌2次，于105 ℃烘至恒重，以g干菌體/L發(fā)酵液表示菌體生物量。

1.4.2 油脂提取

采用酸熱法，油脂含量為油脂量占生物量的質(zhì)量百分數(shù)[13]。

1.4.3 殘?zhí)菧y定

采用山東省科學(xué)院生產(chǎn)的 SBA-50B生物傳感分析儀進行葡萄糖測定。

1.4.4 氮含量的測定

凱氏定氮法，用KDN-2C型定氮儀 (上海嘉定纖檢) 測定。

1.4.5 油脂脂肪酸組成分析

采用GC-7890型氣相色譜儀進行分析。色譜條件為：FFAP石英毛細管柱 (30 m×0.32 mm× 0.4 μm)；進樣器溫度250 ℃；進樣量0.2 μL；載氣N241 mL/min，檢測器 (FID) 溫度280 ℃；H233 mL/min，空氣100 mL/min；柱溫190 ℃；分流進樣。脂肪酸通過對照標準樣品定性，采用面積歸一法確定相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)培養(yǎng)中穩(wěn)態(tài)的確定

圓紅冬孢酵母在批式培養(yǎng)進行到35 h后，開始以D=0.02 h?1的稀釋率補加新鮮的恒化培養(yǎng)基1，并以相同速率排放出發(fā)酵液。隨著恒速補料進行，發(fā)酵液中殘?zhí)侵鸩缴?，生物量逐漸下降。當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)進行到 265 h后，發(fā)酵液中殘?zhí)呛蚈D600不再變化，培養(yǎng)進入了相對穩(wěn)態(tài)。此時，發(fā)酵液中殘?zhí)欠€(wěn)定在 55 g/L左右，OD600在 12左右 (圖 1)。從恒速補料到進入穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)了230 h，運行了4.6個工作體積，這與其他產(chǎn)油酵母恒化培養(yǎng)中到達穩(wěn)態(tài)的結(jié)論基本一致[26]。因此，在圓紅冬孢酵母連續(xù)培養(yǎng)中，條件改變后流加5個工作體積培養(yǎng)可進入穩(wěn)態(tài)。

2.2 稀釋率對油脂積累的影響

通過流加恒化培養(yǎng)基 2，稀釋率從 0.02 h?1增加到0.24 h?1，圓紅冬孢酵母胞內(nèi)油脂含量和生物量呈現(xiàn)出相反趨勢。油脂含量從57.1%下降到10.4%，生物量由4.0 g/L下降到不足0.5 g/L，而殘?zhí)呛縿t逐漸升高 (圖2)?？梢娤♂屄蕦A紅冬孢酵母油脂含量和生物量影響比較明顯。Gill等考察在以葡萄糖為底物的情況下，稀釋率從0.06 h?1到0.21 h?1對Candida 107油脂積累的影響，在稀釋率為0.06 h?1時獲得最大油脂含量，為40%[27]。Alvarez等以甘蔗糖蜜為底物，考察不同稀釋率對 Rhodotorula glutinis油脂積累的影響，發(fā)現(xiàn)隨著稀釋率減小，胞內(nèi)油脂含量逐漸增加，在稀釋率為0.04 h?1時獲得了最大油脂含量[14]?？梢娫诓煌a(chǎn)油微生物和不同底物條件下，胞內(nèi)油脂含量均隨著稀釋率減小而增大。工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)物得率和生產(chǎn)強度是兩個重要指標。從表1中可以看到，隨著稀釋率增大，油脂得率和菌體得率逐漸下降，在0.02 h?1時油脂得率和菌體得率均最大，分別為 0.18 g 油/g糖和0.31 g菌體/g糖。當(dāng)稀釋率由0.24 h?1減小到0.02 h?1時，油脂得率提高9倍，菌體得率提高1.8倍。油脂最大生產(chǎn)強度出現(xiàn)在D=0.14 h?1時，表明在此條件下油脂合成和菌體生長均處在較旺盛狀態(tài)。

圖1 圓紅冬孢酵母的連續(xù)培養(yǎng)Fig. 1 Continuous culture of R. toruloides.

圖2 稀釋率對圓紅冬孢酵母油脂發(fā)酵的影響Fig. 2 Effect of dilution rate on lipid accumulation by R. toruloides.

表1 不同稀釋率下油脂發(fā)酵結(jié)果Table 1 Results of lipid production by R. toruloides in under different dilution rate

從以上結(jié)果可以看出：稀釋率對圓紅冬孢酵母連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂影響較大。在低稀釋率下有利于獲得較高油脂得率，但不利于提高油脂生產(chǎn)強度。因為在較低稀釋率下，氮源嚴重不足，限制了微生物增殖。由于油脂是胞內(nèi)產(chǎn)物，其產(chǎn)量同時受到胞內(nèi)油脂含量和微生物數(shù)量影響。

2.3 碳氮比對油脂積累的影響

在產(chǎn)油微生物培養(yǎng)過程中，當(dāng)?shù)磪T乏時腺苷一磷酸 (AMP) 脫氨酶活性增強，將AMP轉(zhuǎn)化為肌苷一磷酸 (IMP) 和氨。通常產(chǎn)油酵母線粒體中異檸檬酸脫氫酶 (ICDH) 為AMP依賴型脫氫酶，細胞內(nèi)AMP濃度降低將減弱該酶的活性，導(dǎo)致線粒體內(nèi)檸檬酸含量增加。檸檬酸透過線粒體膜進入細胞溶膠，在腺苷三磷酸：檸檬酸裂解酶 (ACL) 作用下裂解生成乙酰輔酶A和草酰乙酸，在脂肪酸合酶 (FAS) 作用下完成脂酰輔酶A合成[28]。

在考察碳氮比對油脂含量影響研究中，Turcotte等研究發(fā)現(xiàn)碳氮比為77時，不論何種氮源菌體內(nèi)油脂含量均在30%以上[29]。李永紅等通過優(yōu)化培養(yǎng)基，在碳氮比為420時，圓紅冬孢酵母油脂含量達到76%[24]。Papanikolaou等報道當(dāng)培養(yǎng)基碳氮比從83.5增加到133.5時，刺孢小克銀漢霉 Cunninghamella echinulata油脂含量從36%增加到47%；深黃被孢霉Mortierella isabellina油脂含量由50%提高到56%[30]。本文通過恒化培養(yǎng)的方式，在D=0.1 h?1的條件下考察了碳氮比對圓紅冬孢酵母油脂發(fā)酵的影響 (表2)。

表2 不同碳氮比培養(yǎng)基主要成分Table 2 Composition of medium in different C/N ratios

圖3 碳氮比對圓紅冬孢酵母油脂積累的影響Fig. 3 Effect of C/N ratios on lipid accumulation by R. toruloides.

從圖3中可以看出：培養(yǎng)基中初始碳氮比增大，菌體內(nèi)油脂含量逐漸增大。當(dāng)碳氮比由 18增大到237時，菌體內(nèi)油脂含量由28.8%增加到38.0%，僅提高9.2%。可見，在恒化培養(yǎng)中增大碳氮比雖然能夠提高菌體內(nèi)油脂含量，但是變化不明顯。因為在連續(xù)培養(yǎng)過程中，油脂積累不僅和培養(yǎng)基初始碳氮比相關(guān)，同時也受稀釋率影響。在碳氮比一定的情況下，稀釋率較大，單位時間內(nèi)流過生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基較多，導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)營養(yǎng)成分豐富，氮源充足，因此不利于油脂積累。而隨著稀釋率減小，反應(yīng)器內(nèi)氮源匱乏，有利于油脂積累。而當(dāng)稀釋率一定的情況下，培養(yǎng)基中碳氮比越大，反應(yīng)器內(nèi)氮源較為匱乏，有利于油脂生成。反之，則不利于油脂合成。但當(dāng)碳源充足情況下，油脂合成更依賴于稀釋率[31]。生物量隨著碳氮比增加呈現(xiàn)逐漸下降。這主要是因為當(dāng)碳氮比大于 92時，發(fā)酵液中氨氮含量僅為0.01 g/L，氮源成為生長限制因素，導(dǎo)致生物量下降。Hassan等通過連續(xù)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)：隨著被消耗碳氮比減小，生物量和油脂含量均呈下降趨勢[23]，李永紅等在油脂批式發(fā)酵研究中也表明：胞油脂含量隨著初始碳氮比減小而下降[24]?？梢?，油脂發(fā)酵初始碳氮比和被消耗碳氮比均與產(chǎn)油微生物胞內(nèi)油脂含量呈相同趨勢。

通過表3可以看出：隨著培養(yǎng)基中碳氮比增大，油脂得率變化不大。菌體得率在碳氮比從18增加到92時變化不大，在237時明顯降低?？梢娫诟咛嫉认录毎L明顯受到抑制。李永紅等[24]的研究論文也有過相同報道，但其在批式發(fā)酵中碳氮比高達694時才產(chǎn)生抑制作用，這是因為兩種培養(yǎng)模式不同。批式培養(yǎng)過程中的環(huán)境隨培養(yǎng)時間變化，恒化培養(yǎng)在穩(wěn)態(tài)條件下其環(huán)境相對穩(wěn)定，更有利于考察不同條件對微生物生長和產(chǎn)物積累影響。油脂生成速率和菌體生成速率隨著碳氮比增大均先升高后降低。在碳氮比為32時，獲得最大油脂生成速率和菌體生成速率，分別為0.13 g/(L·h) 和0.40 g/(L·h)。

2.4 碳氮比對油脂脂肪酸成分的影響

將油脂轉(zhuǎn)酯化后，采用氣相色譜法對5個不同碳氮比下獲得的油脂脂肪酸成分進行分析。從表4中可以看到：不同碳氮比對油脂脂肪酸組成影響不大，脂肪酸主要包括肉豆蔻酸 (14∶0)、棕櫚酸 (16∶0)、棕櫚油酸 (16∶1)、硬脂酸(18∶0)、油酸 (18∶1)、亞油酸 (18∶2) 和亞麻酸 (18∶3)，這和已報道的結(jié)果一致[18]。油脂脂肪酸成分主要是棕櫚酸、硬脂酸和油酸，三者的含量占油脂總脂肪酸含量85%以上。這些油脂的脂肪酸組成和含量表明其可作為生物柴油的原料[32]。

表3 不同碳氮比下油脂發(fā)酵結(jié)果Table 3 Results of lipid production by R. toruloides under different C/N ratios

表4 不同碳氮比下油脂脂肪酸成分Table 4 Fatty acids compositions of lipid samples produced under different initial C/N ratios

3 結(jié)論

圓紅冬孢酵母經(jīng)過5個工作體積恒化培養(yǎng)后進入穩(wěn)態(tài)。在穩(wěn)態(tài)條件下，菌體內(nèi)油脂含量、油脂得率和菌體得率隨稀釋率增大而減小。油脂生成速率和菌體生成速率在稀釋率為0.14 h?1時最大。在穩(wěn)態(tài)條件下，隨著碳氮比增大，菌體油脂含量逐漸增加。當(dāng)碳氮比從18增加到237時，油脂含量提高 9.2%。碳氮比對菌體得率影響不明顯，但油脂得率隨碳氮比增大有所增高。在碳氮比為 32時，獲得最大油脂生成速率和菌體生成速率。在低稀釋率和高碳氮比時，有利于胞內(nèi)油脂積累，但由于在此條件下氮源嚴重缺乏，菌體生長受到限制，不利于提高油脂生產(chǎn)強度。碳氮比對油脂脂肪酸組成沒有明顯影響，但脂肪酸相對含量上有所不同，棕櫚酸、硬脂酸和油酸總含量超過85%。

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