穿琥寧注射液類過(guò)敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

李春英 梁愛(ài)華 趙雍 易艷 王云庭，2 李桂琴（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京00700；2首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，00069）

穿琥寧注射液類過(guò)敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

李春英1梁愛(ài)華1趙雍1易艷1王云庭1，2李桂琴1（1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700；2首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，100069）

目的：研究小鼠和大鼠對(duì)穿琥寧注射液的類過(guò)敏反應(yīng)，為其臨床用藥提供參考。方法：①小鼠全身類過(guò)敏試驗(yàn)：ICR小鼠隨機(jī)分組，分別一次性靜脈注射生理鹽水、Compound 48/80溶液或不同濃度穿琥寧注射液，以上受試物中均含0.4%伊文思藍(lán)。給藥后30min記錄各組動(dòng)物耳廓藍(lán)染陽(yáng)性率，進(jìn)行耳廓藍(lán)染程度評(píng)分，并定量測(cè)定耳廓伊文思藍(lán)滲出量。②大鼠皮膚類過(guò)敏試驗(yàn)：將大鼠背部和脊柱兩側(cè)的毛剃去，經(jīng)尾靜脈注射含0.6%伊文思藍(lán)的生理鹽水溶液2m L/kg，10m in后，在麻醉?xiàng)l件下沿脊柱兩側(cè)皮內(nèi)注射受試藥，每個(gè)點(diǎn)注射50μL。每只鼠均平行設(shè)有陰性對(duì)照點(diǎn)（生理鹽水50μL）和陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)（Compound 48/80 500μg）。20min后，掀開(kāi)皮膚觀察皮膚內(nèi)藍(lán)斑形成情況，測(cè)量藍(lán)斑大小。結(jié)果：小鼠靜脈注射穿琥寧注射液50、100、200mg/kg（分別相當(dāng)于臨床劑量的1/2、等倍和2倍劑量）均可引起小鼠類過(guò)敏反應(yīng)，表現(xiàn)為耳廓血管通透性增高，耳廓不同程度藍(lán)染；大鼠皮內(nèi)注射穿琥寧注射液50、100μg，可觀察到注射局部明顯水腫，形成較大的藍(lán)斑（與陰性對(duì)照組比較P<0.05）。結(jié)論：穿琥寧注射液對(duì)小鼠和大鼠均可引起顯著的類過(guò)敏反應(yīng)，提示在臨床治療中具有潛在的類過(guò)敏反應(yīng)的可能。

穿琥寧注射液；類過(guò)敏反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)研究

穿琥寧注射液主要成分為穿琥寧 （14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯-3，19-二琥珀酸半酯單鉀鹽），主要用于病毒性肺炎、病毒性上呼吸道感染的治療。然而，近年來(lái)由于穿琥寧注射液導(dǎo)致的藥品不良反應(yīng)不斷增多，其不良反應(yīng)類型以急性過(guò)敏樣反應(yīng)為主。從其不良反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間來(lái)看，多數(shù)發(fā)生在第1次用藥過(guò)程中或當(dāng)天[1]，因此推測(cè)其不是免疫球蛋白（Ig）E介導(dǎo)的“過(guò)敏反應(yīng)”（Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)），而是“類過(guò)敏反應(yīng)”。已知類過(guò)敏反應(yīng)與Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的癥狀類似，但二者發(fā)生機(jī)制不同。“Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)”需要有致敏過(guò)程，使機(jī)體產(chǎn)生IgE，再次用藥時(shí)才發(fā)生反應(yīng)。而“類過(guò)敏反應(yīng)”不需要致敏過(guò)程，首次接觸藥物即發(fā)生反應(yīng)。關(guān)于類過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制目前并不十分明確[2-3]。本研究利用前期已經(jīng)建立的類過(guò)敏試驗(yàn)動(dòng)物模型，研究穿琥寧注射液的類過(guò)敏反應(yīng)，為臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

成年健康ICR小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量22～25 g，動(dòng)物合格證號(hào)：0249028；成年健康SD大鼠，雌性，SPF級(jí)，體質(zhì)量260～280g，動(dòng)物合格證號(hào)：0243037。以上動(dòng)物均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 藥品和儀器

穿琥寧注射液（天津藥業(yè)焦作有限公司，規(guī)格：2 m L/40 mg，批 號(hào) ：09040341）；Compound 48/80（Sigma公司，批號(hào)：40M 4047）；伊文思藍(lán)（EB）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：WC20070607）；丙酮（北京化工廠，批號(hào)：10100407）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：110507406）；BHM 36Humalyzer 3000半自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)）。

2 方法

2.1 小鼠耳血管通透性試驗(yàn)

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組、Compound 48/80 25 mg/kg組、穿琥寧注射液50、100、200mg/kg組，每組10只。各組小鼠分別靜脈注射給予含0.4%EB不同受試物20 m L/kg，觀察給藥后30 m in內(nèi)動(dòng)物的行為學(xué)變化及耳廓藍(lán)染情況。記錄每組出現(xiàn)耳廓藍(lán)染的動(dòng)物數(shù)、藍(lán)染總耳數(shù)、耳廓藍(lán)染面積。于注射受試物后30 min將動(dòng)物脫頸椎處死。沿耳根剪下雙耳，剪碎，用2 m L丙酮-生理鹽水（7∶3）混合浸泡，置于 4℃冰箱浸泡過(guò)夜，萃取耳廓內(nèi)滲出的染料。3 000 r/min離心15 m in，取上清液于610 nm處測(cè)吸光度（A）。根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算EB染料滲出量（μg）。根據(jù)每組出現(xiàn)耳廓藍(lán)染的動(dòng)物數(shù)計(jì)算耳廓藍(lán)染的陽(yáng)性率（以下簡(jiǎn)稱反應(yīng)率）：

根據(jù)藍(lán)染耳數(shù)計(jì)算耳藍(lán)染率；根據(jù)EB滲出量與對(duì)照組比較計(jì)算出升高率；耳廓藍(lán)染面積（S）即藍(lán)染面積占耳廓面積的比按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：0分： 雙耳無(wú)藍(lán)染；1分：0＜ S≤1/8；2分：1/8＜S≤1/4；3分 ：1/4＜S≤1/2；4分 ：1/2＜S≤3/4；5分：3/4＜S≤1。

2.2 大鼠皮膚類過(guò)敏試驗(yàn)

將大鼠背部和脊柱兩側(cè)的毛剃去。經(jīng)尾靜脈注射含0.6%EB的生理鹽水溶液2m L/kg。于靜脈注射EB后10m in，在腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg使大鼠麻醉的條件下，沿脊柱兩側(cè)分別皮內(nèi)注射陰性對(duì)照溶液（生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照溶液（Compound 48/80 500μg）、穿琥寧注射液 25、50、100μg，在每只大鼠上每種受試物分別注射2個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)注射50μL。20 m in后，掀開(kāi)皮膚觀察皮膚內(nèi)藍(lán)斑形成情況，測(cè)量藍(lán)斑大小，直徑大于6 mm者判定為陽(yáng)性。不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑計(jì)算方法為長(zhǎng)徑與短徑之和的一半。

3 統(tǒng)計(jì)分析

小鼠耳廓EB滲出量以及大鼠藍(lán)斑直徑數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用One-Way ANOVA進(jìn)行分析。每組反應(yīng)率、耳藍(lán)染率均采用Fisher精確概率法與陰性對(duì)照組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；耳廓藍(lán)染面積采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

4 結(jié)果

4.1 小鼠全身類過(guò)敏反應(yīng)

從一般情況來(lái)看，陰性對(duì)照組動(dòng)物均無(wú)異常。穿琥寧注射液200 mg/kg靜脈注射給藥后，小鼠迅速發(fā)生驚厥、跳躍、呼吸困難等嚴(yán)重類過(guò)敏癥狀，輔以胸外按摩得以存活。100 mg/kg組也出現(xiàn)不安、跳躍和呼吸困難癥狀。50 mg/kg組未見(jiàn)明顯行為異常。陽(yáng)性藥（Compound 48/80 25mg/kg）對(duì)照組活動(dòng)減少，未見(jiàn)驚厥、抽搐、呼吸急促或死亡等。

小鼠靜脈注射給予陽(yáng)性藥Compound48/80 25 mg/kg后，所有動(dòng)物均出現(xiàn)雙耳不同程度藍(lán)染，反應(yīng)率和耳藍(lán)染率均達(dá)100%，耳廓EB滲出量明顯增高，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.001）；穿琥寧注射液 50、100、200 mg/kg組可引起部分動(dòng)物耳廓藍(lán)染，反應(yīng)率分別為40%、20%、30%，與對(duì)照組比較均有不同程度升高，但無(wú)明顯劑量關(guān)系。對(duì)耳廓滲出的EB進(jìn)行定量分析結(jié)果顯示，穿琥寧注射液各劑量組與對(duì)照組比較均有所升高，其中50 mg/kg組與對(duì)照組比較耳廓EB滲出量明顯增高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 穿琥寧注射液致小鼠耳廓血管通透性增高反應(yīng)（n=10）

4.2 大鼠皮膚類過(guò)敏試驗(yàn)

陽(yáng)性藥Compound48/80 500μg組所有注射點(diǎn)均出現(xiàn)大面積藍(lán)斑，藍(lán)斑直徑平均達(dá)到19.40 cm，明顯大于對(duì)照組（P<0.001）；穿琥寧注射液 50、100μg組的藍(lán)斑陽(yáng)性率直徑分別為70%、100%，與對(duì)照組比較陽(yáng)性率顯著增高（P<0.05，P<0.001），藍(lán)斑直徑達(dá)到6.40、8.74 cm。與對(duì)照組比較均明顯增大（P<0.001）。結(jié)果見(jiàn)表2。

5 討論

血管通透性增高是類過(guò)敏反應(yīng)的主要病理機(jī)制之一，由于血管通透性增高，血漿滲出到組織間隙，可引起組織水腫，顯現(xiàn)出皮膚、黏膜起疹、紅腫、瘙癢等；肺組織血管通透性增高及其炎性滲出，可導(dǎo)致咳嗽、喘息、呼吸困難等；嚴(yán)重類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)，由于大量血漿滲出，血容量下降，同時(shí)炎性因子導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張，可引起血壓下降乃至休克等。本實(shí)驗(yàn)室曾以血管通透性增高為指征建立注射劑小鼠類過(guò)敏反應(yīng)模型，即在注射劑受試物中加入EB生理鹽水溶液，使EB濃度達(dá)到0.4%，然后給小鼠靜脈注射，由于EB是小分子物質(zhì)，當(dāng)其靜脈注射入血液后，很快與大分子白蛋白結(jié)合，當(dāng)血管壁完整時(shí)，EB不會(huì)滲出到血管外，因而動(dòng)物的耳廓不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)染。但當(dāng)血管壁通透性增高時(shí)，EB可隨著血漿中的白蛋白滲出到血管外，進(jìn)入組織間隙，使血管外組織藍(lán)染。由于小鼠耳廓的皮膚很薄，耳廓藍(lán)染情況清晰可辨，所以可通過(guò)耳廓藍(lán)染發(fā)生率和耳廓藍(lán)染面積分級(jí)，判斷血管通透性增高的程度[4-6]。

表2 穿琥寧注射液致大鼠皮膚藍(lán)染情況（n=10）

大鼠靜脈注射給予EB，其與血漿中的白蛋白結(jié)合。從背部皮內(nèi)注射給予不含指示劑的受試物，如果受試物不存在誘導(dǎo)血管通透性增高的作用時(shí)（如生理鹽水），則在注射部位局部形成藍(lán)色斑點(diǎn)很?。ɑ旧现睆剑?.6 cm）。但是，如果皮內(nèi)注射的受試物具有誘導(dǎo)血管通透性增高的作用時(shí)，則注射部位會(huì)由于血管通透性增高而導(dǎo)致局部水腫，因而形成較大面積的藍(lán)斑。根據(jù)藍(lán)斑直徑大小可判斷受試物的類過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度[7]。

一般認(rèn)為類過(guò)敏反應(yīng)具有劑量關(guān)系。在本研究中，穿琥寧注射液引起的小鼠類過(guò)敏反應(yīng)癥狀與劑量成正比，高劑量組癥狀最重，中劑量組也有較明顯的癥狀，但比高劑量組輕；低劑量組的癥狀最輕。然而，從小鼠耳廓血管通透性增高結(jié)果看，穿琥寧注射液的反應(yīng)劑量關(guān)系似乎不明顯，可能與劑量較高時(shí)動(dòng)物的全身狀況較差有關(guān)。在大鼠皮膚類過(guò)敏試驗(yàn)中，由于是局部給藥，并且給藥劑量較小，因此對(duì)全身的影響不明顯，穿琥寧注射液在該試驗(yàn)中顯示出與劑量成正比。

本研究結(jié)果表明，穿琥寧注射液可引起較嚴(yán)重的類過(guò)敏反應(yīng)，劑量較高時(shí)可導(dǎo)致呼吸困難和死亡。穿琥寧注射液的類過(guò)敏反應(yīng)與血管通透性增高有一定關(guān)系，小鼠和大鼠實(shí)驗(yàn)均可檢測(cè)出穿琥寧注射液誘導(dǎo)的血管通透性增高。但從小鼠的類過(guò)敏嚴(yán)重程度來(lái)分析，除了血管通透性增高以外，可能其他病理機(jī)制如肺組織氣道平滑肌痙攣對(duì)穿琥寧注射液的類過(guò)敏反應(yīng)預(yù)后也起著重要作用。

在本研究中，穿琥寧注射液有造成小鼠耳廓血管通透性增高以及誘導(dǎo)大鼠皮內(nèi)血管通透性增高的作用，該研究結(jié)果可以解釋穿琥寧注射液在臨床上的某些“過(guò)敏反應(yīng)”癥狀，如皮膚起疹、瘙癢等。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，劑量越高反應(yīng)越重，甚至可危及生命，提示臨床上應(yīng)嚴(yán)格控制用藥劑量，不可盲目加量。

類過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制并不十分清楚，目前認(rèn)為類過(guò)敏反應(yīng)主要是由直接刺激肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺和類胰蛋白酶等或激活補(bǔ)體從而釋放上述生物活性物質(zhì)這兩條主要途徑造成，而不是由經(jīng)典的免疫途徑介導(dǎo)[8-9]。有關(guān)穿琥寧注射液的類過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制有待將來(lái)進(jìn)一步研究。

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The Experimental Study on Anaphylactoid Reactions of Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection

LiChunying1， Liang Aihua1， Zhao Yong1， YiYan1， Wang Yunting1，2， LiGuiqin1（1 Institute of Chinese Material Medica of China Academy of Chinese Medicine Sciences，Beijing 100700，China;2 School of Traditional Chinese Medicine of Capital Medical University， 100069）

Objective:To investigate the anaphylactoid reactions of potassium dehydroandrograpolide succinate injection（PDSI） inm ice and rats so as to provide a scientific guidance for its clinical therapy.Methods:①Anaphylactoid reaction test in m ice:ICR m ice were random ly assigned to receive intravenously physiological saline，compound 48/80 solution or different concentrations of PDSI respectively， containing 0.4%Evans blue（EB） .Thirty minutes later， the auricle aizen positive rate of each animal was recorded，the auricle aizen degree score and the quantitative determination of auricle EB seepage quantity were made.②Cutaneous anaphylaxis test in rats：rats were given physiological saline solution containing 0.6%EB by tail vein intravenous injection.Ten minutes later， 50μL solutions of PDSI in different concentrations were given to anesthetized rats by intra dermal injection on both sides of spine.Each rat is parallel with negative control point（physiological saline 50μL） and positive control point（compound 48/80 500μg）.Twenty minutes later，blue plaque in skin was measured and the absorbance of EB extraction of skin was quantitative determined.Results:The study of anaphylactoid reaction test in mice showed that all three doses of PDSI（50，100 and 200mg/kg，equivalent respectively to 1/2， 1 and 2 times of clinical doses） induced anaphylactoid reactions， as the vascular permeability increased and ear blue stained at different extent.The study of cutaneous anaphylaxis test in rats showed that PDSIata dose of 50 and 100mg/kg can induce edema at the injection site and form a larger locus blue plaque（vs.the negative control group， P<0.05）.Conclusion:It was proved thatanaphylactoid reactions can be induced evidently by PDSIboth in mice and rats，indicating that anaphylactoid reactions may happen in clinical therapy.

Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection；Anaphylactoid Reaction；Experimental Study

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.12.009

國(guó)家自然科學(xué)基金（90709043），國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAI14B05），國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2009ZX09301-005，2009ZX09502-001）

李春英，女，助理研究員。研究方向：中藥藥理與毒理研究。E-mail:lcy121858@sina.com

梁愛(ài)華，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥安全性評(píng)價(jià)、中藥毒性及其機(jī)理研究、中藥抗腫瘤、抗炎、免疫和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制研究。通訊作者E-mail:liangaihua@sina.com

2012-10-08）