Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在生后發(fā)育大鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核中的表達(dá)

龐有旺 鄭季南 洪慶南 方 鈞

（解放軍泉州第180醫(yī)院骨科，福建泉州362000）

三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元傳遞口面部空間位置信息和閉口肌運(yùn)動(dòng)信息［1］。三叉神經(jīng)中腦核向三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的直接投射組成咀嚼運(yùn)動(dòng)的單突觸反射環(huán)路，在調(diào)控咀嚼運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用［2－4］。以往國(guó)內(nèi)、外研究表明大鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體神經(jīng)終末為三叉神經(jīng)中腦核中樞突終末［5－7］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光鏡下觀察了大鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性纖維終末在生后發(fā)育過程中變化。

材料和方法

本實(shí)驗(yàn)共用了18只Sprague-Dawley幼年大鼠和3只成年大鼠。把幼鼠出生日作為newborn、然后依次為生后1d、2d等。newborn、生后3、7、10、14、21d和成年每個(gè)年齡段各取3只（非同窩）。在戊巴比妥鈉（60mg／kg）腹膜腔注射深麻醉下，先用0.025mol／L磷酸緩沖液配制的生理鹽水（PBS，pH7.3）經(jīng)心臟沖洗血液，至流出的液體無血色，再用50-300ml含0.2%多聚甲醛和75% （v／v）飽和苦味酸的0.1mol／L的磷酸緩沖液（pH7.3）灌注固定15-30min。灌畢立即取腦并浸于含2%多聚甲醛和75%飽和苦味酸的0.1mol／L PBS后固定24－48h（4℃），然后移入含25%蔗糖的0.1mol／L的PB中，4℃過夜。冰凍連續(xù)冠狀切片，片厚40μm，切片分2套，分別收集于0.05mol／L的PBS中。

第1套切片用于VGluT1免疫組織化學(xué)染色。具體步驟如下：（1）用兔抗 VGluT1IgG（0.8μg／ml，日本京都大學(xué)金子武嗣先生惠贈(zèng)）孵育切片過夜；（2）生物素標(biāo)記的驢抗兔IgG（1∶100，Jackson）室溫孵育4h；（3）移入 ABC-Elite（1∶100，Vector）孵育切片3h。其中步驟（1）和（2）用含5%驢血清、0.05%疊氮鈉、0.5%Triton X-100和0.25%角叉菜膠的0.05mol／L 的 PBS稀 釋，步 驟（3）用 含 0.3%Triton X-100的0.05mol／L的PBS稀釋。然后進(jìn)行DAB反應(yīng)和雙氧水呈色。裱片、脫水透明、DPX封片。光鏡下觀察并拍照。

第2套切片用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。省略一抗血清或用正常血清替代一抗血清進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。

結(jié) 果

新生幼鼠的三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核就可觀察到Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，呈低強(qiáng)度，分布在背外側(cè)部，此時(shí)一個(gè)顯著的特征是三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核周區(qū)不能探查到Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽(yáng)性結(jié)構(gòu)（圖a）。出生后的第一周是幼鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)快速增長(zhǎng)期，新生、生后3d、生后7d每階段都有明顯增加（圖a-c），生后7d已經(jīng)接近成年表達(dá)水平（圖a-f）。生后第二周，幼鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)也有逐漸增加（圖d-e），生后14d幼鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)的Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)達(dá)到成年模式（圖e-f）。

討 論

三叉神經(jīng)中腦核中樞突與三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形成單突觸反射通路，該通路以谷氨酸作為遞質(zhì)［8］。作為一種氨基酸，谷氨酸在神經(jīng)元內(nèi)既是神經(jīng)遞質(zhì)，又是中間代謝產(chǎn)物。在神經(jīng)元內(nèi)，谷氨酸只有被轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸囊泡內(nèi)才可以發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)功能。近年已經(jīng)證明分布在囊泡膜的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有三種亞型，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸到突觸囊泡內(nèi)［5－7］。在大鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)，Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)于三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元的中樞突［9］。大鼠發(fā)育過程中Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元的胞體和外周突中的表達(dá)變化以往已經(jīng)進(jìn)行了研究報(bào)道［10］。本文觀察了大鼠生后發(fā)育過程中三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)變化。我們觀察到Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在新生大鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)已經(jīng)表達(dá)，表明胚胎發(fā)育過程中已建立了三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元發(fā)揮興奮性突觸傳遞功能。出生后Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)表達(dá)快速增進(jìn)，1w內(nèi)已接近成年水平，2w后達(dá)到成年水平，為幼鼠的咀嚼活動(dòng)奠定了基礎(chǔ)。

以往的研究表明三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)多種谷氨酸受體，包括AMPA和NMDA受體，有多種AMPA和NMDA受體亞型在剛出生幼鼠的三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)［11－13］。生理學(xué)研究表明單突觸反射環(huán)路中通過AMPA和NMDA受體引起三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核神經(jīng)元的興奮［14－15］。顯然Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在生后大鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)的表達(dá)是與受體的表達(dá)是匹配的。發(fā)育過程中，神經(jīng)環(huán)路的建立依賴神經(jīng)活動(dòng)［16］，因而盡管哺乳期幼鼠以吮吸、吞咽等活動(dòng)為主，咀嚼活動(dòng)較少，Ⅰ型囊泡膜谷氨運(yùn)體在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)表達(dá)可能也具有重要生理意義，比如參與神經(jīng)環(huán)路的建立。但詳細(xì)的作用需要進(jìn)一步研究。

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圖 版 說 明

圖 三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核光學(xué)顯微鏡像示大鼠生后不同發(fā)育階段Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體免疫組織染色。新生大鼠（圖a），生后3d（圖b），生后7d（圖c），生后10d（圖d），生后14d（圖e）和成年大鼠（圖f）。Vmo，三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核。標(biāo)尺＝150μm （圖a-f）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.Microphotographs through the trigeminal motor nucleus showing vesicular glutamate transporter 1 immunoreactivty in newborn（Fig.a），3-day-old（Fig.b），7-day-old（Fig.c），10-day-old（Fig.d），14-day-old（Fig.e）and adult rat（Fig.f）.Vmo，trigeminal motor nucleus.Bar＝150μm （Fig.a-f）.