藍(lán)莓汁生產(chǎn)熱燙工藝對(duì)多酚氧化酶及多酚類化合物的影響

楊秀松

（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 高級(jí)研修學(xué)院，北京 100073）

藍(lán)莓屬于漿果類，營(yíng)養(yǎng)豐富，其果實(shí)除含有糖、酸和Vc外，還富含維生素E、胡蘿卜素、以及豐富的K、Fe、Zn、Mn等微量元素。據(jù)測(cè)定，每100g藍(lán)莓含蛋白質(zhì)0.5g，脂肪0.1g，碳水化合物12.9g，Ca 8mg，F(xiàn)e0.2mg，P9mg，K70mg，Na1mg，Zn0.26mg，Se 0.1mg，胡蘿卜素9mg，Vc 9mg，VE 1.7mg。除營(yíng)養(yǎng)成分外，藍(lán)莓果實(shí)中還含有大量以花色甙為主的植物化學(xué)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。野生種花色甙色素含量高達(dá)0.33～3.38g/100g鮮果，栽培種一般為0.07～0.15g/100g鮮果。

藍(lán)莓果實(shí)含有大量的多酚氧化酶（PPO），在藍(lán)莓加工過(guò)程中多酚氧化酶與花色苷及其它酚類物質(zhì)充分接觸，催化酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致果汁褐變。熱處理可鈍化PPO，防止褐變的發(fā)生，工業(yè)上常采用沸水熱燙或蒸汽熱燙。但藍(lán)莓屬于漿果，沸水熱燙造成營(yíng)養(yǎng)成分及功能成分的流失。采用蒸汽熱燙，降低熱處理造成的抗氧化成分的損失。本文研究了熱燙條件對(duì)多酚氧化酶滅活的效果以及探討了熱燙條件對(duì)果汁抗氧化能力的影響，主要是針對(duì)藍(lán)莓汁清除超氧陰離子和羥自由基的能力。

1 材料與試劑

1.1 材料和試劑

藍(lán)莓：野生藍(lán)莓，產(chǎn)自大興安嶺。藍(lán)莓汁的提取是將野生藍(lán)莓經(jīng)蒸汽熱燙、打漿、離心得到的上清液。1.7mg·mL-1LDL（協(xié)和生化所）。除三羥甲基氨基甲烷（Tris）為進(jìn)口分裝外，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或國(guó)產(chǎn)生化試劑。配制用水均為二次蒸鎦水。

1.2 儀器和設(shè)備

熱電偶數(shù)字顯示巡回檢測(cè)儀型號(hào)XMD（上海自動(dòng)化儀表六廠）；UV2754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；UVIKONXL紫外分光光度計(jì)（法國(guó)SECOMAM）；超級(jí)恒溫水浴（上海市實(shí)驗(yàn)儀廠）；AE-4650電泳槽（ATTO公司）；AE-8150電泳電壓裝置（ATTO公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多酚氧化酶（PPO）的提取及酶活力的測(cè)定

將藍(lán)莓按1∶2的料液比加入冷凍至-25℃的丙酮打漿，迅速抽濾，殘?jiān)美滹L(fēng)吹干至無(wú)丙酮味，即得丙酮粉。丙酮粉用pH值為7.4的0.10mol·L-1的磷酸鹽緩沖液提取，冷凍離心得粗酶液。

比色皿中加入2mL pH值為4.0的NaAc緩沖液、0.01 mol·L-1的綠原酸溶液0.7mL以及0.3mL粗酶提取液，在400nm下測(cè)吸光值隨時(shí)間的變化。以每毫升粗酶反應(yīng)液在前2min內(nèi)吸光值隨時(shí)間的變化情況計(jì)為酶活單位（吸光值·（mL·min）-1）。多酚氧化酶酶活的計(jì)算公式：

式中 M：每秒鐘增加的吸光值；V：粗酶液的體積mL。

2.2 超氧陰離子清除能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定法測(cè)定，原理為鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化、釋放出超氧陰離子，生成有色的中間產(chǎn)物，可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。中間產(chǎn)物在320nm有強(qiáng)烈光吸收，當(dāng)有抗氧化物存在時(shí)，可清除超氧陰離子，所以可以通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)計(jì)算清除率從而判斷其抗氧化性。

采用鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定法，25℃下，在4.0mLTris-HCL溶液（pH=8.2）加入 1.0mL的 3mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，迅速混勻，測(cè)定樣品管時(shí)加入1.0mL的藍(lán)莓汁，測(cè)定基底管時(shí)不加樣品而用Tris-HCL溶液定容為6mL，然后倒入石英比色杯內(nèi)，在320nm波長(zhǎng)光線下，每隔30s測(cè)吸光值A(chǔ)一次，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

按下式計(jì)算藍(lán)莓汁對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率（S%）

式中 A空：空白試管中溶液吸光度值；A底：只有基底的試管中溶液吸光度值；A樣：加入樣品的試管中溶液吸光度值。

2.3 羥自由基清除能力的測(cè)定

清除羥自由基實(shí)驗(yàn)的原理為：Fe2＋-EDTA、抗壞血酸及過(guò)H2O產(chǎn)生·OH使脫氧核糖降解，在酸性環(huán)境中，降解產(chǎn)物可與TBA反應(yīng)，形成粉紅色物質(zhì)，可用比色法測(cè)知脫氧核糖的降解情況，了解受試物是否具有清除·OH的能力。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：取干凈的10mL硬質(zhì)管，加入PBS緩沖液（KH2PO4-K2HPO4pH=7.4）0.4mL，再加入 0.1mL的樣品液（包括 1.04mmol·L-1EDTA-1mmol·L-1Fe-SO41mmol·L-1Vc）和 12mmol·L-1H2O20.1mL，再加入 60mmoL·L-1DR（脫氧核糖）0.05mL，然后用 PBS緩沖液定容為1.0mL。將管中液體混合均勻后置于37℃的恒溫水浴鍋中保持1h。水浴完畢取出，迅速添加1mL 10%TCA（三氯乙酸）及1mL 1%TBA（硫代巴比妥酸），在100℃沸水中加熱15min取出，冷卻。于532nm處測(cè)吸光值，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

按下式計(jì)算藍(lán)莓汁對(duì)羥自由基（OH·）的清除率（S%）

式中 A模型：模型管吸光度（不加樣品）；ADR：加入清除劑和DR后的吸光度；A樣品：樣品本身的吸光度（不加DR）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，采用SAS9.0軟件包對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

3.1 熱燙對(duì)多酚氧化酶（PPO）活性的影響

熱燙的主要目的是使藍(lán)莓的內(nèi)源性多酚氧化酶失活，防止果汁發(fā)生酶促褐變，因而熱燙要使藍(lán)莓的中心溫度達(dá)到一定值才能保證藍(lán)莓的PPO完全失活。通入蒸汽時(shí)間越長(zhǎng)，中心溫度越高，酶的失活越徹底，但活性成分的損失也越嚴(yán)重，因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了籠屜式與堆放式兩種熱燙方式，比較蒸汽通入時(shí)間對(duì)多酚氧化酶和抗氧化成分的影響。

設(shè)定的蒸汽通入時(shí)間為 1、2、3、4min，并以未通入蒸汽為對(duì)照。測(cè)定加入藍(lán)莓粗酶后20、40、60、80、100、120s綠原酸溶液光密度的變化，計(jì)算多酚氧化酶的活性。兩種熱燙方式在不同蒸汽通入時(shí)間下多酚氧化酶的活性見(jiàn)圖1、2。

圖1 籠屜式熱燙蒸汽通入時(shí)間對(duì)多酚氧化酶的滅活作用Fig.1 Effect of steaming time of streaming heating on deactivation to polyphenoloxidase

圖2 堆放式熱燙蒸汽通入時(shí)間對(duì)多酚氧化酶的滅活作用Fig.2 Effect of steaming time of stack heating on deactivation to polyphenoloxidase

由圖1、2可見(jiàn)，籠屜式熱燙可在2min達(dá)到對(duì)多酚氧化酶的滅活作用，堆放式熱燙則需要4min才能鈍化多酚氧化酶。結(jié)果表明，籠屜式熱燙效果好于堆放式。這和堆放式物料體積較大，中心溫度上升較慢有關(guān)。

3.2 熱燙對(duì)藍(lán)莓汁抗氧化能力的影響

超氧陰離子自由基（O2-·）是體內(nèi)造成機(jī)體氧化損傷最主要的自由基，可造成蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷，清除超氧陰離子自由基（O2-·）的能力可反映體系的抗氧化損傷的能力。為此，分別將蒸汽通入時(shí)間為1、2、3、4min制備的藍(lán)莓汁1mL加入反應(yīng)體系，測(cè)定其對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 蒸汽通入時(shí)間對(duì)藍(lán)莓汁超氧陰離子自由基清除能力的影響Tab.3 Effect of steaming time on clean of free radical of superoxide anion

羥自由基是另一種主要自由基，對(duì)DNA的損傷作用較強(qiáng)。分別將蒸汽通入時(shí)間為1、2、3、4min制備的藍(lán)莓汁0.1mL加入反應(yīng)體系，測(cè)定其對(duì)羥自由基（OH·）的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 蒸汽通入時(shí)間對(duì)果汁羥自由基清除能力的影響Tab.4 Effect of steaming time on clean of hydroxy radical

由圖3、4可見(jiàn)，兩種熱燙方式下，隨蒸汽通入時(shí)間的延長(zhǎng)，果汁對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基的清除能力均呈下降趨勢(shì)，其中籠屜式熱燙對(duì)自由基的清除能力的影響更大、衰減更快。但從籠屜式的滅酶時(shí)間2min和堆放式的滅酶時(shí)間4min看，籠屜式熱燙保留的抗氧化成分要多一些。上述結(jié)果表明，籠屜式熱燙比堆放式適合藍(lán)莓汁的制備。

4 結(jié)論

多酚氧化酶是一類以Cu2+為輔基的氧化還原酶，通過(guò)分子氧催化酚類物質(zhì)氧化得到醌，隨后發(fā)生醌聚合而產(chǎn)生褐變反應(yīng)。同時(shí)影響產(chǎn)品多酚的含量和抗氧化活性。通過(guò)加熱的方式可以滅活多酚氧化酶，防止果汁褐變。但同時(shí)加熱也可以造成多酚物質(zhì)的氧化，使其抗氧化活性降低。因此抑制多酚氧化酶、保存多酚的抗氧化活性是藍(lán)莓果汁制備的關(guān)鍵質(zhì)量控制目標(biāo)之一。

酶與多酚的失活和加熱溫度、加熱時(shí)間呈正相關(guān)，因此，加快到達(dá)中心溫度的時(shí)間、減少溫度的維持時(shí)間，既可使多酚氧化酶失活，又可以盡可能地保留多酚的抗氧化活性。為此，本文設(shè)計(jì)了籠屜式加熱與堆放式加熱兩種熱處理方式，結(jié)果表明籠屜式熱燙處理好于堆放式熱燙?；\屜式熱燙2min可達(dá)到滅活多酚氧化酶的效果，同時(shí)可保留較多的多酚類抗氧化成分。這是因?yàn)榛\屜式熱燙操作過(guò)程中物料厚度小，到達(dá)中心溫度的時(shí)間快，因而通入蒸汽2min即可起到滅酶作用，比堆放式到達(dá)滅酶時(shí)間（4min）短，因而多酚破壞少。

［1］楊麗勇.藍(lán)莓的營(yíng)養(yǎng)保健功能及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2007，（4）:24-25.

［2］李亞?wèn)|，張志東，吳林.藍(lán)莓果實(shí)的成分及保健機(jī)能［J］.資源與生產(chǎn),2002，（1）:27-28.

［3］李穎暢，孟憲軍.藍(lán)莓花色苷抗氧化活性的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，（9）：61-64.

［4］劉玉田，趙玉平，鄒琴.藍(lán)莓干紅的抗氧化能力分析［J］.釀酒，2008，（1）：98-100.

［5］劉淑蘭，呂秀蓮，王曉軍，等，越橘的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，（6）：53-54.

［6］盛潔.神奇果——藍(lán)莓［J］.醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào)，2008，（2）：18.

［7］羅建光，楊曉彤，楊慶堯.大型藥用真菌降血脂作用研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，（11）：2296-2298.

［8］Simonian NA,Coyle JT.Oxidative stress in neurodegenerative disease［J］.Annu.Rev.Pharmacol Toxicol,1993,36:83-106.

［9］Ross R.The pathogenesis of ather osclerosis a perspective for the 1990s［J］.Nature,1993,362:801-809.

［10］Berliner JA,Heinecke JW.The role of oxidized lipoprotein in atherogenesis［J］.Free Radic Biol.Med.，1996，（5）:707-727.

［11］Chen,K,Thomas,S.R.,Keaney,J.F.Beyond LDL oxidation:ROS in vascular signal transduction［J］.Free Radical Biology Medicin,2003,35（2）：117-123.

［12］Kwak BR,Mulhaupt F.Ather osclerosis:anti-inflammatory and immunomodulatory activities ofstatins［J］.Autoimmun Rev.,2003,（2）:332-338.

［13］Kuo C,Campbell LA.Detection of Chlamydia pneumoniae in arterial tissues［J］.J.Infect Dis,2000,181（3）:432-436.

［14］LibbyP,TanakaH.The molecula bases of restenosis［J］.Progcadiovase Dis.，1997,40（2）:97.

［15］Celmaje DS.Endothelial dysfunction dose is matter Is it reversibly［J］.AmColl Cardiol,1997,30:325.

［16］Danesh J,Wheeler JG,Hirschfield GM,et al.C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary herartdisease［J］.N.Engl.J.Med.，2004,350:1387-1397.