正交超聲法提取魚腥草多糖工藝研究*

羅 馨，趙衛(wèi)星，溫普紅

（寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工系，陜西 寶雞 721013）

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb）又名蕺菜、側(cè)耳根、魚鱗草等，是三白草科（Saururaceae）蕺菜屬（Houttuynia）多年生草本植物[1]，為我國傳統(tǒng)常用藥物之一。在我國僅有一種，原名“蕺”，始載于《名醫(yī)別錄》下品。《本草綱目》載：“其葉腥氣，故俗名魚腥草?！眲e名豬鼻孔、雞兒根等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明魚腥草富含人體所需蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷、鐵及VC、VE等多種營養(yǎng)成分，同時還含有多糖、黃酮、揮發(fā)油類等多種藥用成分，是一種“藥食兼用型”的野生植物，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效[1，2]。主要用于肺膿瘍、痰熱咳嗽、熱痢熱淋、癰瘡腫毒、消癰排濃、殺蟲、消積、健脾、止血。廣泛分布于我國南方各省區(qū)。

本研究通過單因素實驗選擇和正交設(shè)計法對魚腥草中多糖進(jìn)行微波提取，以魚腥草中的多糖提取率為指標(biāo)，分別對料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)等因素進(jìn)行考察，優(yōu)化出微波法提取魚腥草多糖的最佳條件。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

魚腥草購于寶雞醫(yī)藥大廈，95%乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、丙酮均為分析純。

722 N型分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；2NHW-Ⅱ型電子調(diào)溫電熱套（鞏義市予華儀器有限公司）；KQ-2200DE型數(shù)控超生清洗器（昆山市超生儀器有限公司）；800B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；101-2型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京科威儀器有限公司）。

1.2 魚腥草粗多糖的提取

魚腥草60℃干燥后，粉碎過40目篩,精確稱粉4.0g,放入500mL的燒杯中,加一定體積蒸餾水浸泡24h,在一定溫度下，超聲波提取一定時間，過濾，棄去殘渣，超聲波重復(fù)提取一定次數(shù)，合并濾液后，濃縮，再加用一定80%乙醇去脂肪，靜置沉淀后，將上層懸浮物用離心機(jī)離心（4000r·min-1,30min），取出，合并沉淀，將沉淀溶于丙酮中充分洗滌靜置過夜，沉淀再次用無水乙醇中充分洗滌后，靜置，待沉淀完全后將沉淀物置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加熱至一定體積，經(jīng)真空干燥得到魚腥草粗多糖[3，4]。

1.3 多糖含量測定方法[5-7]

1.3.1 測定原理 苯酚-硫酸法測定多糖含量[8-9]，其基本原理是蔗糖在濃H2SO4作用下（圖1），分子內(nèi)脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛，它們能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在490nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定吸光度。本實驗以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。此法簡單，試劑便宜,靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的干擾。

圖1 戊糖和己糖脫水反應(yīng)Fig.1 Dehydration reaction of pentose and hexose

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取20mL刻度試管11支編號，按表1加入溶液和蒸餾水待測定。

表1 苯酚法測定可溶性糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量Tab.1 Drawing standard curve of the amount of reagent in detemination of soluble sugar by phenol method

然后按順序向試管內(nèi)加入1.00mL濃度為9%苯酚溶液，搖勻，再從管液正面以5～20s加入5.00 mL濃H2SO4，搖勻。比色液總體積為8.0mL，在室溫下放置30min，比色，以試劑空白為參比，在490nm波長下測定吸光度A，以糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸見圖2。

圖2 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of sucrose

回歸方程為：A=0.0087C-0.0033，R2=0.9999。

1.4 多糖的測定

精確稱取真空干燥恒重后的魚腥草多糖500mg,水溶解后定容到100.0mL容量瓶中,搖勻,作為多糖儲備液。精確量取多糖儲備液2.00mL,定容置250.0mL量瓶中,再分別取2.00mL置25.00mL量瓶中，然后加入4%苯酚溶液1.00mL，搖勻后迅速加入7.00mL濃硫酸，定容，在室溫放置30min，以相應(yīng)試劑為空白對照，在490nm測定其吸收度。

2 單因素選擇實驗

2.1 料液比的選擇

料液比（m/V）分別為 1∶10；1∶15；1∶20；1∶25；1∶30，提取溫度為 70℃，提取時間均為 30min，提取3次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果多糖提取率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比的影響Fig.3 Effect of material liguid

圖3結(jié)果表明，隨著料液比的增加，魚腥草多糖提取率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當(dāng)料液比（m/V）為1∶20時，多糖提取率最大為5.22%，當(dāng)料液比增加時，提取率下降，故選料液比（m/V）為1g∶20mL。

2.2 提取溫度選擇

選擇單因素實驗2.1中的最佳料液比（m/V）為1g∶20mL，分別在 40、50、60、70、80℃ 5 個溫度下提取多糖，提取時間均為30min，提取3次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果多糖提取率，見圖4。

圖4 提取溫度的影響Fig.4 Effect of entraction temperature

圖4結(jié)果表明，隨著提取溫度的增加，魚腥草多糖同樣提取率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當(dāng)提取溫度為70℃，多糖提取率最大為5.22%，溫度高于40℃多糖含量下降，分析原因可能是隨著溫度的升高，魚腥草多糖開始降解以及蛋白質(zhì)逐漸溶出。另外升高溫度并在長時間浸提條件下可能會影響多糖的生理活性，因此，綜合考慮多糖的提取量及活性等各種因素，選取70℃為適宜的提取溫度。

2.3 提取時間選擇

選擇單因素實驗2.1和2.2中的最佳料液比（m/V）為1g∶20mL和提取溫度70℃，提取時間分別為 10、20、30、40、50min，提取時間均為 30min，提取3次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果多糖提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時間的影響Fig.5 Effect of extraction time

由圖5可見，隨著提取時間的增加，魚腥草多糖同樣提取率呈現(xiàn)升高趨勢，當(dāng)提取時間30min，多糖提取率最大為5.22%，提取時間在30min后多糖含量反而下降，這說明此時大多數(shù)的多糖已經(jīng)溶出并達(dá)到平衡，再延長提取時間對提取多糖不利。因此，提取魚腥草多糖所需的適宜時間為40 min。

2.4 提取次數(shù)

選擇單因素實驗2.1、2.2、2.3中的最佳料液比（m/V）為 1g∶20mL、提取溫度 70℃、提取時間 40 min，提取分別為1,2,3,4,5次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果多糖提取率，結(jié)果見圖6。

圖6 提取次數(shù)的影響Fig.6 Effect of extraction times

圖6結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，魚腥草多糖同樣提取率呈現(xiàn)升高趨勢，當(dāng)提取次數(shù)3次時，多糖提取率最大為5.22%，隨著提取次數(shù)增加，多糖提取率增加不大，為節(jié)省資源，魚腥草多糖提取次數(shù)選為3次。

3 最佳條件的確定

在單因素選擇實驗的基礎(chǔ)上，多魚腥草多糖提取的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用L9（34）正交試驗，選取料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）和提取次數(shù)（D）4個因素，每個因素選擇3個水平，具體設(shè)計見表2，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，結(jié)果見表3。

表2 魚腥草多糖正交L9（34）因素及水平設(shè)計表Tab.2Polysaccharides of L9（3）4orthogonal design table of factors and levels

表3 魚腥草多糖正交L9（34）實驗結(jié)果及分析Tab.3Polysaccharides of L9（3）4orthogonal experiment results and analysis

正交試驗結(jié)果（表3）表明，影響微波法提取魚腥草多糖的主要因素依次為：提取時間（C）≈料液比（A）＞提取溫度（B）＞提取次數(shù)（D），最佳組合為：A2B3C3D1，即最佳條件：料液比（m/V）為 1∶20、提取溫度為80℃、提取時間為40min、提取次數(shù)為2次，優(yōu)化后在此條件下重復(fù)試驗，魚腥草多糖提取率可達(dá)5.35%。

4 結(jié)論

本實驗采用超聲提取技術(shù)，超聲作用可以破碎細(xì)胞，改變植物的組織，加速溶解有效成分，催進(jìn)擴(kuò)散和傳質(zhì)超聲提取適用于多種天然植物的有效成分的提取，如生物堿，萜類化合物，黃酮化合物，脂質(zhì)核揮發(fā)油等。超聲提取伴隨強(qiáng)度很大的聲波的傳播會出現(xiàn)聲沖流，聲空化，聲輻射力以及聲致發(fā)光等許多非線性過程，具有空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)、和化學(xué)效應(yīng)等特點。保持有效成分活性的同時也減少了色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的析出，簡化了提取純化的流程，是一種良好的提取多糖的方法。

本研究采通過單因素實驗選擇對魚腥草中多糖進(jìn)行微波提取，以魚腥草中的多糖提取率為指標(biāo)，分別考察了對料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)等因素對提取率的影響，通過正交設(shè)計法對微波法提取魚腥草多糖的最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化：料液比（m/V）為1∶20、提取溫度為80℃、提取時間為40min、提取次數(shù)為2次。本研究優(yōu)化的實驗條件，對于今后開發(fā)利用魚腥草多糖有重要的意義。

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