心臟特異表達(dá)腎素（原）受體轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

廉 虹，馬元武，劉 寧，全雄志，張連峰

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

腎素-血管緊張素系統(tǒng) （renin-angiotensin system，RAS）是控制血壓和和體內(nèi)電解質(zhì)平衡經(jīng)典的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。2002年，Nguyen等［1］利用重組的帶有放射性標(biāo)記的人源腎素，在人類腎臟cDNA庫(kù)中篩選出了一個(gè)與以往發(fā)現(xiàn)的任何膜受體蛋白均無(wú)同源性的受體蛋白，即腎素（原）受體［（p）RR］。（p） RR是一種小分子量蛋白，含有350個(gè)氨基酸，分子量35～39×103，由大段的細(xì)胞外（EC）部分，單次跨膜區(qū)（TM）和一個(gè)短的細(xì)胞內(nèi)（IC）部分組成。由于腎素（原）受體最初發(fā)現(xiàn)是與V-ATPase（囊泡H+-ATPase）偶聯(lián)，所以編碼此蛋白的基因被命名為ATP6ap2（ATPase 6 accessory protein2）［2，3］。

（p）RR在人體內(nèi)廣泛表達(dá)：其中在心臟、腦、胎盤中表達(dá)最多，在肝、腎臟和胰腺中表達(dá)次之，在肺和骨骼肌組織也有少量表達(dá)。序列比對(duì)分析顯示，（p）RR在各物種間的同源性非常高，人的（p）RR與大鼠、小鼠、雞、青蛙和斑馬魚(yú)等均具有較高同源性［4］，推測(cè)這個(gè)基因在生命體中具有重要的功能。在人類此基因存在于X染色體上。至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種與（p）RR相關(guān)的疾病，一種是該基因的4號(hào)外顯子的剪切增強(qiáng)子發(fā)生321位C〉T的沉默突變引起神經(jīng)系統(tǒng)智力缺陷、癲癇和共濟(jì)失調(diào)等病癥［5］；第二種是（p）RR基因多態(tài)性的（IVS）5+169C〉T （rs5918007）基因型與人類高血壓相關(guān)［6，7］。

（p）RR敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，這很大程度的限制了研究者的研究進(jìn)程。隨后，Celine A等［8］構(gòu)建了血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）特異表達(dá)（p）RR的轉(zhuǎn)基因大鼠，發(fā)現(xiàn)6月齡的大鼠出現(xiàn)血壓升高、心率加快的現(xiàn)象，并且癥狀隨年齡的增加更加嚴(yán)重。在糖尿病大鼠的心臟中，（p）RR在蛋白和mRNA水平均增加三倍［9］。這些結(jié)果說(shuō)明（p）RR可能參與高血壓與糖尿病等病理過(guò)程。由于該基因在心肌中有廣泛表達(dá)，我們推測(cè)它在心臟的生理功能中發(fā)揮一定的作用。因此，本文構(gòu)建了心臟特異表達(dá)（p）RR的轉(zhuǎn)基因小鼠，并初步探討了該基因?qū)π呐K功能的影響。

1 材料和方法

1.1 （p）RR基因的克隆和轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

從OriGene公司購(gòu)買的帶有（p）RR cDNA的質(zhì)粒（Sc111138），通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得帶有SalI和AflII酶切位點(diǎn)的（p）RR基因cDNA目的片斷，引物序列如下Ps（SalI）：5＇-CCGGTCGACCACCATGGC TGTGTTTG-3＇；Pa（A flII）：5＇-CTCTACTTAAGCAT CACAGGCACACACAA-3＇（由invitrogen公司合成）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，變性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃2m in，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后克隆到pMD18-T Vector，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，正確無(wú)突變堿基序列連入α-MHC（Genbank accession no.U_71441，clone 26）啟動(dòng)子下游，構(gòu)建心臟特異表達(dá)（p）RR的轉(zhuǎn)基因載體，經(jīng)NotⅠ將表達(dá)載體線性化，Sephedex G50柱純化，將DNA濃度調(diào)整至5 ng/μL，用顯微注射法注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中（C57BL/6J康藍(lán)公司SCXK（京）2004001），用ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠（TE2000-U顯微注射儀）。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物福利和管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：ILASGC-2010-033。

1.2 PCR法鑒定（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［10］，用PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)。αMHC-（p） RR轉(zhuǎn)基因小鼠PCR引物序列如下Ps：5＇ CTTTCAGTCACATTGCGGCA-3＇，Pa：5＇-TGCGTTCCC ACCATAGAGAC-3＇（由invitrogen公司合成），反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 m in，變性94℃30 s，退火59℃30 s，延伸72℃30 s，共30個(gè)循環(huán)。

1.3 Westernblot

用小鼠脫頸椎法，犧牲小鼠，取100 mg心臟組織加入1 m L預(yù)冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上靜置30 min，再將組織勻漿于4℃，12000 r/ m in離心30 m in，吸取上清即為心臟組織總蛋白。取30μg蛋白上樣，15％的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素NC膜上（Millipore，美國(guó)）。5％脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1 h，再用TBST稀釋的羊抗人源重組的（p）RR多克隆抗體（AF5176，R＆D，美國(guó)）（1∶250稀釋），4℃搖床雜交過(guò)夜。次日，待恢復(fù)室溫后，TBST洗3次，每次10 min。置入TBST稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊抗體（Pierce，美國(guó)）（1∶15000），室溫雜交1 h，采用HRP-GAPDH作為內(nèi)參，TBST洗3次，每次10 min。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中，X-Ray膠片曝光、顯影及定影。

1.4 免疫組織化學(xué)

選用3月齡的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和同窩陰性小鼠心臟固定在中性福爾馬林中24 h，進(jìn)行脫水、包埋、切片，常規(guī)脫蠟入水，枸櫞酸鈉抗原熱修復(fù)，待恢復(fù)室溫后3％H2O2去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉，滴加（p）RR抗體（AF5176，R＆D，美國(guó)）（1∶50稀釋），濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜；PBS洗3×5 min后加入兔抗山羊二抗（具體用法詳見(jiàn)二步法免疫組化試劑盒，PV-2003），PBS洗3×5 m in，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，光鏡下常規(guī)觀察病理切片。

熱修復(fù)和去除過(guò)氧化物酶的病理切片，分別滴加識(shí)別高爾基體標(biāo)志蛋白抗體：GM30（ab1299，Abcam，美國(guó)）（1∶100）/識(shí)別肌漿網(wǎng)標(biāo)志蛋白抗體：PDI（ab2792，Abcam，美國(guó)）（1∶100）和（p）RR抗體（ab64957，Abcam，美國(guó)）（1∶25稀釋）濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，PBS洗3×5 min后加入DyLight-標(biāo)記的抗小鼠IgG（1∶100，KPL）and A lexa 488-標(biāo)記的羊抗兔IgG （1∶100，Invitrogen）37℃孵30 min，ProLong Gold抗淬滅劑封片（Invitrogen）。制備好的病理切片利用共聚焦顯微鏡觀察分析（Leica TCS SP2，Germany）.

1.6 心臟超聲檢查

選用3月齡的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和同窩陰性小鼠，用三溴乙醇（0.2 m L/10g體重）麻醉，脫去心前區(qū)的被毛，選用30 Hz的探頭，按Zhou［11］報(bào)道的方法進(jìn)行心臟超聲影像分析（Vevo770小動(dòng)物超聲探測(cè)系統(tǒng)，加拿大）。記錄左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at end-systole，LVID；s）等參數(shù)，左室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV），射血分?jǐn)?shù)（percent ejection fraction，EF％），短軸縮短率（percent fractional shortening，F(xiàn)S％）由計(jì)算得出。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理。先進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 （p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

用PCR法從購(gòu)買的質(zhì)粒中擴(kuò)增出人源（p）RR基因，測(cè)序結(jié)果顯示同已報(bào)道的（p）RR序列完全一致（GenBank No.NM_005765.2），將其連到α-MHC心臟特異表達(dá)的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建α-MHC-（p）RR轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體（彩插3圖1A）。小鼠出生14 d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增（p）RR基因339 bp目的片段，鑒定（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型（彩插3圖1B），共得到4只首建鼠，且均可傳代。分別提?。╬）RR首建鼠的F1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對(duì)照小鼠心臟組織總蛋白，用（p）RR抗體進(jìn)行Western blot分析，篩選出一個(gè)高表達(dá)明顯的品系，Western blot圖譜顯示有三條目的帶，分子量大小分別約為：35×103，30×103和28×103。35×103的蛋白帶是全長(zhǎng)的（p）RR，30×103和28×103兩條蛋白帶為其截短形式［s（p）RR］，從圖中我們可以看出，轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織內(nèi)全長(zhǎng)的（p）RR蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯增加，而兩種截短的蛋白表達(dá)量卻明顯的高于同窩陰性小鼠（彩插3圖1C）。取1月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠用（p）RR抗體進(jìn)行心臟免疫組化分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟中（p）RR的表達(dá)明顯高于同窩陰性對(duì)照小鼠（彩插3圖1D）。

2.2 免疫熒光共聚焦方法進(jìn)行（p）RR亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位

取3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠，取出心臟制備成石蠟切片，分別用識(shí)別高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志分子的抗體與（p）RR抗體進(jìn)行雙色熒光免疫組化分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠的（p）RR蛋白與兩種細(xì)胞器的標(biāo)志分子能達(dá)到共定位，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因表達(dá)的（p）RR蛋白與內(nèi)源（p）RR蛋白均存在于高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并且可以看出轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中（p）RR蛋白的表達(dá)要明顯高于同窩陰性對(duì)照小鼠心臟中的表達(dá)（彩插4圖2A，B）。

2.3 超聲檢查（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟幾何構(gòu)型及心功能

將3月齡的 （p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠進(jìn)行心臟超聲影像分析（表1），結(jié)果顯示，與同窩陰性對(duì)照小鼠相比，（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠收縮期左室內(nèi)徑（LVID，systolic）降低9％（P＜0.05，n= 18），收縮期容積（LVESV，systolic）減少了23％（P＜0.05，n=18），射血分?jǐn)?shù)EF（ejection fraction）升高14％（P＜0.01，n=18），短軸縮短率FS（fraction shortening）升高20％（P＜0.01，n=18）。結(jié)果說(shuō)明，（p）RR基因的轉(zhuǎn)入增強(qiáng)了心臟的收縮性能，使心功能有了明顯的提高。

2.4 轉(zhuǎn)基因表達(dá)（p）RR基因使轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中鈣泵、鈉-鈣交換體1表達(dá)下調(diào)，肌鈣蛋白T表達(dá)上調(diào)

提取3月齡的（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠心臟組織總蛋白，進(jìn)行鈣泵（ATP2A2）、鈉-鈣交換體1（NCX 1）以及肌鈣蛋白T（cTnT）抗體的Western blot檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATP2A2和NCX 1表達(dá)均下調(diào)，其中鈣泵表達(dá)量的降低十分顯著；而肌鈣蛋白T表達(dá)量上調(diào)（圖3）。

3 討論

自2002年Nguyen等［1］首次報(bào)道了人腎素（原）受體的存在之后，人們關(guān)于此受體的生物功能研究都集中在全長(zhǎng)的（p）RR形式。Cousin等［12］通過(guò)對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞（E14），大鼠平滑肌細(xì)胞（VSMC）和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）等多種細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)28×103（p）RR低分子量形式的存在，由于這種形式的蛋白是在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的，所以被命名為s（p）RR。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，s（p）RR是由弗林蛋白酶剪切產(chǎn)生的，而且s（p）RR存在于血漿和尿液中。不久，Yoshikawa等［13］發(fā)現(xiàn)了一種由ADAM19剪切產(chǎn)生的游離在培養(yǎng)基中一種s（p）RR形式，這兩種s（p）RR形式是否是（p）RR的同一種剪切形式以及它們各自的功能，現(xiàn)在還有待進(jìn)一步研究。本文構(gòu)建的（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠，除了全長(zhǎng)的（p）RR外，兩條截短的蛋白從分子量大小上看，應(yīng)該就是以上兩篇文獻(xiàn)中的所發(fā)現(xiàn)的s（p）RR，本文構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠全長(zhǎng)（p）RR蛋白沒(méi)有明顯增多而兩種s（p）RR蛋白明顯高于同窩陰性對(duì)照小鼠，這一點(diǎn)還有待進(jìn)一步解釋。這兩個(gè)獨(dú)立的研究小組［12，13］在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中也都進(jìn)行了（p）RR的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明（p）RR主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細(xì)胞器中。本研究在小鼠心臟組織中進(jìn)行了（p） RR蛋白的定位研究，證實(shí)了過(guò)表達(dá)的（p）RR蛋白與內(nèi)源性的（p）RR蛋白在小鼠心臟組織中均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上，并且轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中（p）RR蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照小鼠心臟組織。心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)非常發(fā)達(dá)，對(duì)鈣的儲(chǔ)存、釋放和心臟的收縮、舒張起到重要的作用，（p）RR定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上可能更有利于其參與到心肌節(jié)律性收縮舒張活動(dòng)過(guò)程中。高爾基體是將蛋白進(jìn)行加工、分類和包裝的主要場(chǎng)所，推測(cè)（p）RR的兩種s （p）RR形式在高爾基體上被剪切產(chǎn)生，并且駐留于此。

表1 三月齡（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能M超生分析（n=18） Tab.1 The cardiac structure and function analysis of 3-month transgenic mice by M-mode echocardiograph（n=18）

圖3 轉(zhuǎn)基因表達(dá)（p）RR引起ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表達(dá)變化Fig.3 Transgenic（p）RR leading to alter the expression level of ATP2A2/NCX 1/cTnT

鈣離子作為興奮-收縮的偶聯(lián)介質(zhì)，在維持心肌正常收縮和舒張過(guò)程中起到重要的作用。心肌細(xì)胞的收縮和舒張與細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放與儲(chǔ)存相偶聯(lián)。鈣循環(huán)主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存的鈣的釋放、鈣的回?cái)z和鈣的儲(chǔ)存三個(gè)過(guò)程。位于細(xì)胞膜表面的L型鈣通道受到刺激后會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的RyR受體（ryanodine receptor）從而引起內(nèi)網(wǎng)中鈣的釋放，此時(shí)游離的鈣離子會(huì)結(jié)合肌鈣蛋白引起肌絲的滑動(dòng)，使心肌產(chǎn)生收縮運(yùn)動(dòng)，隨著舒張過(guò)程的開(kāi)始內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的ATP2A2逐步將細(xì)胞內(nèi)游離的鈣回收至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，同時(shí)NCX 1也將少部分的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外?？梢钥闯鲈谶@一過(guò)程中ATP2A2和NCX 1主要起到將細(xì)胞中游離的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并且在這一過(guò)程中ATP2A2起到關(guān)鍵的作用。本文中發(fā)現(xiàn)（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中ATP2A2和NCX 1表達(dá)量明顯降低，這顯然影響了游離鈣離子向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的回?cái)z，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)的維持在高濃度的狀態(tài)下，類似于鈣超載的狀態(tài)，使肌鈣蛋白等鈣相關(guān)蛋白不得不繼續(xù)工作，造成心肌收縮力增強(qiáng)。同時(shí)我們檢測(cè)的肌鈣蛋白T在（p）RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)確實(shí)也是升高的。心臟超聲結(jié)果同時(shí)顯示，（p） RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟心功能明顯增強(qiáng)，這也是心肌收縮力增強(qiáng)的結(jié)果。

在心臟中過(guò)表達(dá)（p）RR能夠引起心臟收縮功能明顯增強(qiáng)，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了明顯變化，轉(zhuǎn)基因小鼠心功能增強(qiáng)。過(guò)表達(dá)的（p）RR是如何調(diào)節(jié)這些鈣離子相關(guān)蛋白的從而影響到了心臟功能，這些都有待于我們進(jìn)一步研究。不過(guò)本研究提示我們，（p）RR可能是通過(guò)調(diào)節(jié)心臟中的鈣離子從而影響心肌功能的。在接下來(lái)的的研究中，我們將從分子機(jī)制出發(fā)，探求該轉(zhuǎn)基因小鼠的表型的內(nèi)在機(jī)制，更加深入的研究（p）RR在心臟中的生物學(xué)活性。

（p）RR的發(fā)現(xiàn)，為經(jīng)典的腎素-血管緊張素系統(tǒng)增添了新的內(nèi)容，使這一系統(tǒng)重新成為研究熱點(diǎn)。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)（p）RR在心血管方面的重要性，關(guān)于（p）RR在心臟中發(fā)揮的生物活性還有待進(jìn)一步研究，它可能成為治療心血管疾病的重要靶點(diǎn)并且對(duì)其信號(hào)通路的研究有利于我們對(duì)一些心血管疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的深入了解。

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