藥物安全性評價中豚鼠全身過敏試驗(yàn)方法的研究

翁謝川，樊 星，王青秀，施 暢，李磊寧，歐陽兆和，孔 琦，王全軍，關(guān)勇彪，丁日高

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，國家北京藥物安全評價中心，北京 100850）

藥物可能作為過敏原引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)。藥源性過敏反應(yīng)對人體危害性大，且發(fā)病率高。常見的過敏癥狀包括皮疹、惡心、嘔吐、支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎，嚴(yán)重時可發(fā)生過敏性休克、心功能衰竭等，危及生命［1］。因此，評價藥物可能引起的過敏反應(yīng)成為新藥臨床前安全性評價的一個重要內(nèi)容。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局（State Food and Drug Administration，SFDA）于2005年頒發(fā)的《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》以及《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定，局部給藥發(fā)揮全身作用的藥物（如注射劑和透皮吸收劑等）都需考察Ⅰ型過敏反應(yīng)［2，3］。

在SFDA頒布的指導(dǎo)原則中考察Ⅰ型過敏反應(yīng)最常見的方法為豚鼠（Guinea pig）全身主動過敏試驗(yàn)（active systemic anaphylaxis，ASA）［2，3］。目前普遍認(rèn)為，該方法具有操作相對簡單、敏感性好、結(jié)果穩(wěn)定和可重復(fù)性高等特點(diǎn)［4-7］。但是，在藥物臨床前安全性評價工作中，特別是在操作和制定該過敏試驗(yàn)具體方案時，一些可變的實(shí)驗(yàn)設(shè)計因素，如不同的致敏劑量、激發(fā)劑量、激發(fā)時間、激發(fā)途徑和激發(fā)次數(shù)等，明顯影響著豚鼠全身過敏的發(fā)生，從而影響到臨床前藥物過敏性的評價結(jié)果。因此，為了解決這些重要的可變性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計因素對研究結(jié)果存在的影響，我們對其進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級豚鼠，Dunkin Hartley品系，體重為300～400 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，動物合格證號：SCXK（京）2006-0009；動物使用許可證號：SYXK（軍）2007-0008。飼養(yǎng)于國家北京藥物安全評價研究中心屏障設(shè)施內(nèi)。對飼養(yǎng)的環(huán)境溫度、濕度和噪音進(jìn)行嚴(yán)格控制，溫度控制在20℃±2℃，相對濕度（60±10）%左右，光照周期12 h∶12 h，光照時間為8∶00 AM～8∶00 PM，噪音在60 dB以下。另外，保持飼養(yǎng)環(huán)境中空氣流通，換氣次數(shù)達(dá)到（10～15）次/h。

1.2 試劑

氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號：100705118；牛血清白蛋白，Roche公司，生產(chǎn)批號：738328。

1.3 方法

每組12只，雌雄各半。在實(shí)驗(yàn)的第1、10和19天測量豚鼠體重，并對豚鼠的脫毛狀況進(jìn)行觀察記錄。動物體重的測定時間在上午8∶00～9∶00期間進(jìn)行，體重測量結(jié)束后再飼以食料。

實(shí)驗(yàn)按照SFDA推薦的全身過敏實(shí)驗(yàn)的程序和模式進(jìn)行，分為3個階段（檢疫期、致敏期、激發(fā)期），即購進(jìn)實(shí)驗(yàn)動物稱完體重后，進(jìn)行10 d的檢疫期。檢疫期后，挑選生理狀況合格的動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組。分別在動物實(shí)驗(yàn)的第1天（一次致敏組），第1、3、5天（3次致敏組）或者1、3、5、7、9天（5次致敏組）進(jìn)行腹腔注射致敏；分別在實(shí)驗(yàn)的第12、19、26天根據(jù)組別進(jìn)行腹腔或者腿靜脈注射激發(fā)，激發(fā)劑量為致敏劑量2倍。實(shí)驗(yàn)共分9組，第一組：生理鹽水對照組；第二組：10 mg/kg牛血清白蛋白組（腿靜脈注射激發(fā)）；第三組：50 mg/ kg牛血清白蛋白組（腿靜脈注射激發(fā)）；第四組：100 mg/kg牛血清白蛋白組（腿靜脈激發(fā)）；第五組：100 mg/kg牛血清白蛋白組（腹腔注射激發(fā)）；第六組：50 mg/kg牛血清白蛋白組（第12天經(jīng)腿靜脈注射激發(fā)）；第七組：50 mg/kg牛血清白蛋白組（第26天經(jīng)腿靜脈注射激發(fā)）；第八組：50 mg/ kg牛血清白蛋白經(jīng)靜脈注射激發(fā)組（1次致敏）；第九組：50 mg/kg牛血清白蛋白經(jīng)靜脈注射激發(fā)組（3次致敏）。按不同實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組情況總結(jié)如表1。

1.4 過敏反應(yīng)癥狀的觀察和嚴(yán)重程度分級

按照SFDA頒布的指導(dǎo)原則對過敏反應(yīng)嚴(yán)重程度進(jìn)行評級（見表2）。按照表3所示進(jìn)行全身過敏反應(yīng)強(qiáng)度的評價。

表1 按不同實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組Tab.1 Various groups with different experimental factors

表2 過敏反應(yīng)分級及癥狀Tab.2 Levels and symptoms of allergic reaction

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SAS9.0非參數(shù)檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。差異顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同致敏劑量對豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)的影響

生理鹽水組（Ⅰ組），10 mg/kg（Ⅱ組）、50 mg/ kg（Ⅲ組）和100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅳ組）豚鼠均經(jīng)后腿靜脈注射激發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對照組未發(fā)現(xiàn)明顯的過敏癥狀（激發(fā)劑量：2m l/kg）；第Ⅱ組（10 mg/kg牛血清白蛋白組）5只出現(xiàn)過敏反應(yīng)弱陽性，5只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，2只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性；第Ⅲ組（50 mg/kg牛血清白蛋白組）1只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，8只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性，3只出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性（死亡）；第Ⅳ組（100 mg/ kg牛血清白蛋白組）3只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性，9只出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性（死亡）。具體結(jié)果見表4。

表3 全身過敏反應(yīng)癥狀等級評價標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 Evaluation criteria on symptomsof systemic allergic reaction

2.2 不同激發(fā)給藥途徑對豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)的影響

生理鹽水組（Ⅰ組）、100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅳ組）經(jīng)豚鼠后腿靜脈注射激發(fā)，100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅴ組）經(jīng)腹腔注射激發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對照組12只豚鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的過敏癥狀（激發(fā)劑量：2 m L/kg）；第Ⅳ組3只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性，9只出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性（死亡），過敏反應(yīng)的發(fā)生率為100％（12/12）；第Ⅴ組豚鼠6只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陰性，6只出現(xiàn)過敏反應(yīng)弱陽性，0只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性或者極強(qiáng)陽性，過敏反應(yīng)的發(fā)生率為50％（6/12）。結(jié)果見表5。統(tǒng)計結(jié)果表明，相同劑量的情況下，靜脈激發(fā)給藥出現(xiàn)過敏反應(yīng)的強(qiáng)度高于腹腔注射給藥（d f=2，χ2=29.59，P＜0.05）。

表4 不同組別豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)癥狀等級評價情況Tab.4 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

表5 不同組別豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)癥狀等級評價情況Tab.5 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

2.3 不同激發(fā)給藥時間對豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)的影響

以生理鹽水組（Ⅰ組）為對照組，50 mg/kg牛血清白蛋白致敏的第Ⅲ組、第Ⅵ組和第Ⅶ組豚鼠分別于致敏期結(jié)束后的第3天、第10天和第17天經(jīng)后腿靜脈注射激發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ組12只豚鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的過敏癥狀（激發(fā)劑量：2 m L/kg）；Ⅲ組1只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，8只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性，3只出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性（死亡）；Ⅵ組豚鼠1只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陰性，7只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，4只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性；Ⅶ組4只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，5只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性，2只出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性（死亡）。結(jié)果見表6.統(tǒng)計結(jié)果提示，相同劑量和相同致敏激發(fā)途徑的情況下，第Ⅲ組和第Ⅶ組過敏反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)度要高于第Ⅵ組（df=3，χ2=36.84，P＜0.05）。

2.4 不同致敏次數(shù)對豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)的影響

生理鹽水組（Ⅰ組）作為陰性對照，觀察50 mg/kg牛血清白蛋白致敏次數(shù)不同時，即Ⅲ組5次、Ⅷ組1次和Ⅸ組3次，均經(jīng)后腿靜脈注射激發(fā)時過敏反應(yīng)發(fā)生的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ組12只豚鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的過敏癥狀（激發(fā)劑量：2 m L/kg）；Ⅲ組1只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，8只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性，3只出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性（死亡）；Ⅷ組豚鼠4只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陰性，6只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，2只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性；Ⅸ組3只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽性，8只出現(xiàn)過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性，1只出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性（死亡）。結(jié)果見表7.統(tǒng)計結(jié)果提示，在相同劑量不同致敏次數(shù)的情況下，致敏3次（Ⅸ組）和5次（Ⅲ組）出現(xiàn)過敏反應(yīng)的強(qiáng)度顯著高于1次致敏組（Ⅷ組）（df=3，χ2=39.91，P＜0.05）。

3 討論

免疫毒性是指外源性化合物對機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷作用，包括免疫抑制和免疫增強(qiáng)兩類。藥物引起的過敏反應(yīng)（超敏反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)）、自身免疫反應(yīng)以及不良免疫刺激等都屬于免疫系統(tǒng)反應(yīng)性過度增強(qiáng)所導(dǎo)致的結(jié)果［1］。根據(jù)SFDA頒布的關(guān)于化學(xué)藥物、中藥和天然藥物臨床前免疫毒性評價的技術(shù)指導(dǎo)原則，豚鼠主動全身過敏反應(yīng)所檢測的藥物毒性表現(xiàn)為藥物所致的Ⅰ型過敏反應(yīng)，由IgE介導(dǎo)。該型過敏反應(yīng)在新化合物中發(fā)生率高，在藥物的臨床副作用中比較常見。因此，采用敏感方法和如何評價新藥可能引起過敏反應(yīng)應(yīng)受到足夠的重視。

表6 不同組別豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)癥狀等級評價情況Tab.6 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

表7 不同組別豚鼠發(fā)生全身過敏反應(yīng)癥狀等級評價情況Tab.7 Level on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in four groups

通過比較生理鹽水對照組和不同劑量牛血清白蛋白組（10、50、100 mg/kg）豚鼠全身過敏反應(yīng)發(fā)生的情況，我們發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)的發(fā)生率并沒有隨著劑量的增大而發(fā)生變化（均為100％），但是豚鼠過敏反應(yīng)癥狀的嚴(yán)重程度卻存在明顯的差別（見表4），其中兩個高劑量組50、100 mg/kg發(fā)生反應(yīng)的嚴(yán)重程度明顯高于10 mg/kg。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在新藥的安全性評價中，一定要注意受試藥物劑量的設(shè)計。劑量太低，雖然在一定范圍內(nèi)，過敏反應(yīng)發(fā)生率不變化，但很可能由于過敏反應(yīng)輕微，而被忽視。另外，牛血清白蛋白作為最常見的受試物，如果用其在實(shí)驗(yàn)方案的中作為陽性對照物，我們推薦的適宜劑量為50 mg/kg。主要考慮如果劑量過小，作為陽性對照難以觀察到明顯的過敏反應(yīng)；劑量過大，容易致大量動物死亡，固然能證明實(shí)驗(yàn)體系的正確性，但失去了與實(shí)驗(yàn)組癥狀比較的意義。

根據(jù)指導(dǎo)原則，致敏過程可以采用靜脈、腹腔或皮下注射等方式，這些都是容易產(chǎn)生抗體的給藥方法。但是我們認(rèn)為多次靜脈注射致敏可造成豚鼠不必要的傷害和疼痛，一般不應(yīng)考慮。根據(jù)注射體積的差異，可以選擇腹腔和皮下致敏，由于腹腔致敏無明顯禁忌，一般可為首選。本研究發(fā)現(xiàn)，相同劑量和給藥周期的情況下，腹腔給藥大劑量激發(fā)時，豚鼠發(fā)生過敏反應(yīng)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度明顯降低，過敏反應(yīng)很輕微，不易觀察，其原因可能為腹腔吸收較靜脈慢所致。因此，激發(fā)途徑應(yīng)嚴(yán)格為快速靜脈內(nèi)給藥。本研究還表明，激發(fā)給藥時間過短（第12天）和激發(fā)給藥時間過長（第26天），影響到了過敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生強(qiáng)度，這與抗體IgE產(chǎn)生與消退的時間規(guī)律相關(guān)。因此激發(fā)時間在末次致敏后第10～14天，即檢疫期結(jié)束后第19～23天較為理想。本研究中關(guān)于致敏次數(shù)的結(jié)果表明，致敏次數(shù)過少（1次），不利于抗體的產(chǎn)生，過敏反應(yīng)較弱；致敏次數(shù)太長，會影響到實(shí)驗(yàn)操作成本并在致敏階段引起過敏反應(yīng)，因此在藥物安全性評價中應(yīng)以3～5次為宜。

在GLP條件下進(jìn)行藥物安全性評價，使得影響豚鼠生理狀況的環(huán)境因素（如溫度、濕度、噪音、空氣等）和影響研究結(jié)果的實(shí)驗(yàn)操作因素得到了有效的控制，這在很大程度上保障了實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量和評價的有效性［4-7］。盡管如此，影響豚鼠主動全身過敏反應(yīng)的一些非實(shí)驗(yàn)因素以及操作環(huán)節(jié)仍可以影響到動物的質(zhì)量和評價的結(jié)果。前期的研究中，我們對這些非實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。本研究是此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討指導(dǎo)原則中過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計方面的細(xì)節(jié)因素。研究結(jié)果表明，有必要遵照指導(dǎo)原則，注意實(shí)驗(yàn)方案中的劑量設(shè)計、激發(fā)途徑、致敏次數(shù)和時間間隔，從而有效地評價藥物可能導(dǎo)致的I型過敏反應(yīng)。

［1］霍艷，李波.藥物免疫毒性評價技術(shù)要求的國內(nèi)外進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（20）：1525-1529.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［J］.2005，16-27.

［3］國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則［J］.指導(dǎo)原則編號：GPT5-1.2005，1-20.

［4］葉有春.我國GLP建設(shè)與實(shí)施的幾點(diǎn)問題和建議［J］.安徽醫(yī)藥，2006，10（5）：388-389.

［5］翁謝川，丁日高，袁本利，關(guān)勇彪等.GLP條件下非實(shí)驗(yàn)因素對實(shí)驗(yàn)用豚鼠生理狀態(tài)的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志（中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志），2007，7：11-14.

［6］翁謝川，丁日高，袁本利等.實(shí)驗(yàn)用豚鼠的生物學(xué)特性與飼養(yǎng)管理［J］.生物學(xué)通報，2007，42（1）：13-14.

［7］岑小波，趙瀛蘭，王莉等.從藥品技術(shù)審評的角度看GLP實(shí)施的必要性［J］.中國藥事，2005，19（7）：390-392.