利用光學(xué)成像系統(tǒng)非侵入性監(jiān)測乳腺癌細(xì)胞在骨環(huán)境內(nèi)的生長情況

嚴(yán)偉，金芳純，范啟明，湯亭亭

利用光學(xué)成像系統(tǒng)非侵入性監(jiān)測乳腺癌細(xì)胞在骨環(huán)境內(nèi)的生長情況

嚴(yán)偉，金芳純，范啟明，湯亭亭

目的應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的人乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞系，建立乳腺癌骨移植瘤動物模型，并應(yīng)用活體成像技術(shù)檢測腫瘤的生長情況。

方法注射 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞于 BALB/c 雌性裸小鼠脛骨髓腔，應(yīng)用活體光學(xué)成像系統(tǒng)，連續(xù)觀察腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長情況，同時測量腫瘤體積的變化；4 周和 7 周時拍攝 X 線片并做組織學(xué)檢查，評估腫瘤對骨組織的影響。

結(jié)果利用活體光學(xué)成像系統(tǒng)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，至第 3 ～ 4 周期間，腫瘤進(jìn)入對數(shù)生長期；腫瘤大小與熒光信號強度呈線性正相關(guān)。X 線片和組織切片顯示 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞形成溶骨性的骨破壞。

結(jié)論成功建立了可非侵入性監(jiān)測的乳腺癌骨移植瘤模型，利用活體光學(xué)成像系統(tǒng)結(jié)合 X線片及組織學(xué)檢查能夠直觀、連續(xù)、準(zhǔn)確地檢測腫瘤細(xì)胞在骨環(huán)境內(nèi)的生長情況，為后續(xù)抗腫瘤藥物的篩選和評價提供了新的手段和工具。

乳腺腫瘤； 疾病模型，動物； 診斷顯像；熒光 X 線攝影術(shù)

與生物發(fā)光技術(shù)相比，熒光成像技術(shù)具有標(biāo)記靶點的多樣性、一次可以應(yīng)用不同的熒光基因標(biāo)記不同的細(xì)胞的優(yōu)勢，因而在分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝（如腫瘤細(xì)胞、免疫相關(guān)細(xì)胞）等方面已經(jīng)廣泛應(yīng)用。目前常用的熒光基團以表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）為代表，無需底物即可自發(fā)熒光，對細(xì)胞幾乎無毒性。

本實驗利用穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）的人乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞系，通過裸鼠脛骨髓腔注射，建立乳腺癌骨移植瘤動物模型，利用活體熒光成像技術(shù)對此模型內(nèi)的腫瘤生長進(jìn)行非侵入性的連續(xù)監(jiān)測，同時進(jìn)行 X 線片、組織切片的檢查，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞在骨環(huán)境內(nèi)的生長規(guī)律，為后續(xù)在動物體內(nèi)進(jìn)行抗乳腺癌骨轉(zhuǎn)移藥物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) RFP 標(biāo)記的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231SArfp 獲贈于澳大利亞西澳大學(xué)Jiake Xu 教授，此細(xì)胞系是從乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中分離的細(xì)胞，具有骨轉(zhuǎn)移的特性[15]。常規(guī)培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和 G-418（0.75 mg/ml，用于篩選穩(wěn)定表達(dá) RFP 的細(xì)胞[16]）的 DMEM 培養(yǎng)液（美國HyClone 公司產(chǎn)品）中，置于 CO2體積分?jǐn)?shù)為 5%、37 ℃ 飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.1.2 實驗動物及分組 4 ～ 5 周齡 BALB/c 雌性裸鼠 20 只，體重約 20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，均飼養(yǎng)于無特定病原體的環(huán)境下。10 只用于活體熒光成像檢測，并記錄生存曲線；另外 5 只于注射腫瘤細(xì)胞 4 周后處死，拍攝X 線片并做組織學(xué)檢測，剩余 5 只于注射腫瘤細(xì)胞 7 周后處死，拍攝 X 線片并做組織學(xué)檢測。

1.1.3 儀器 小動物活體成像儀為美國 Xenogen公司的 IVIS spectrum。

1.2 方法

1.2.1 熒光顯微鏡下觀察 MDA-MB-231SArfp細(xì)胞的 RFP 表達(dá) 取對數(shù)生長期的 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞，置于熒光顯微鏡下，觀察其紅色熒光蛋白表達(dá)的情況。

1.2.2 活體成像系統(tǒng)檢測 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞的熒光表達(dá) 用 PBS 緩沖液將 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞在黑色的 96 孔板中進(jìn)行倍比稀釋，每孔 100 μl，細(xì)胞數(shù)從 10 000/孔到 78/孔，最后一孔用 PBS 作為陰性對照。用活體成像系統(tǒng)檢測不同細(xì)胞數(shù)量的熒光強度，采集并分析數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞數(shù)量與熒光強度的量-效關(guān)系曲線。

1.2.3 乳腺癌骨移植瘤模型的構(gòu)建和熒光檢測 取對數(shù)生長期的 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞株以 0.2% 的胰酶消化，用 DMEM 培養(yǎng)液終止消化后，制成細(xì)胞懸液，1000 r/min 離心 4 min 后重懸于 PBS 中。用臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率大于 98%。用 PBS 調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 107/ml；按每只裸鼠 0.1 ml 懸液的劑量注射于20 只 BALB/c 雌性裸小鼠的脛骨髓腔內(nèi)，隨機選取 10 只在 2 h 內(nèi)檢測熒光強度并記錄，以后每周進(jìn)行一次活體熒光檢測并記錄，同時記錄每只裸鼠的死亡時間，繪制生存曲線。

1.2.4 腫瘤體積測量 每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑、短徑和厚度，計算移植瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。移植瘤體積按公式：V = 4/3 π（a × b × c）（V 為腫瘤體積；a 為長徑/2；b 為短徑/2；c 為厚度/2）進(jìn)行計算。

1.2.5 X 射線片和組織學(xué)檢查 注射腫瘤細(xì)胞4 周后和 7 周后分別對荷瘤裸鼠進(jìn)行 X 射線檢查。移植瘤取下后用 4% 多聚甲醛固定 24 h，流水沖洗過夜，以 10% EDTA 于 4 ℃ 脫鈣 3 周后石蠟包埋，做組織切片，HE 染色并觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用 SPSS13.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以x±s表示，相關(guān)性采用 SPEARMAN 等級相關(guān)進(jìn)行分析，雙側(cè)檢驗水準(zhǔn)為 α = 0.05，所有檢驗以P＜ 0.05 認(rèn)為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞的 RFP 表達(dá)

RFP 標(biāo)記的 MDA-MB-231SA 細(xì)胞為多邊形上皮樣細(xì)胞，貼壁生長，熒光顯微鏡觀察可見細(xì)胞表達(dá)的熒光信號較強，熒光較為均勻地分布于整個細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)率接近 100%，細(xì)胞在體外能夠穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白，并且隨體外長期傳代培養(yǎng)無明顯消褪（圖 1）。

2.2 活體熒光成像檢測 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞的 RFP 體外表達(dá)

通過活體熒光成像系統(tǒng) IVIS 觀察不同濃度的 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞熒光表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該成像系統(tǒng)能夠檢測的最小細(xì)胞數(shù)為 500 ～ 700個腫瘤細(xì)胞，儀器靈敏度較高，隨著細(xì)胞濃度的遞增，熒光表達(dá)的強度也逐漸增加，即平均熒光量子數(shù)與細(xì)胞濃度成正比（r2= 0.9449，P＜ 0.05)（圖 2）。

圖 1 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) RFP[A、C 為普通光鏡下照片；B、D 為熒光顯微鏡照片（A、B × 40；C、D × 100）]Figure 1 Fluorescence micrograph incicated that red fluorescence proteins stably expressed in MDA-MB-231SArfp cells.A, C:Bright field; B, D: Fluorescent field (A、B × 40; C、D × 100)

圖 2 活體光學(xué)成像系統(tǒng)體外檢測 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞 RFP 表達(dá)[A：MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞倍比稀釋檢測熒光信號強度；B：細(xì)胞熒光強度與細(xì)胞數(shù)目線性相關(guān)（r2 = 0.9449，P ＜ 0.005）]Figure 2 The RFP expression of MDA-MB-231SArfp cells detected by the optical imaging system in vitro [A: In vitro fluorescent intensity of various cell numbers of MDA-MB-231SArfp cells; B: The correlation analysis between cell numbers and fluorescent intensity (r2 = 0.9449, P ＜ 0.005)]

圖 3 活體光學(xué)成像系統(tǒng)非侵入性監(jiān)測乳腺癌細(xì)胞在骨內(nèi)的生長情況Figure 3 Non-invasive monitoring of the growth of MDA-MB-231SArfp breast cancer cells in bone using the optical imaging system

2.3 活體熒光成像動態(tài)觀察 MDA-MB-231SArfp細(xì)胞在體內(nèi)生長情況

注射 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞 2 h 內(nèi)檢測，能觀察到注射部位的熒光信號。1 周和 2 周后活體熒光成像檢測，熒光信號主要集中于肺內(nèi)，而脛骨部位信號相對較弱，考慮為注射于脛骨髓腔的腫瘤細(xì)胞有部分進(jìn)入血液循環(huán)，在肺內(nèi)有短暫的停留（1 ～ 2 周），肺內(nèi)環(huán)境并非 MDA-MB-231SArfp細(xì)胞最適宜生長的“土壤”，最終循環(huán)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞要么死亡，要么繼續(xù)循環(huán)定植于骨微環(huán)境中。在第 3 ～ 4 周期間，腫瘤進(jìn)入對數(shù)生長期，熒光信號較強且穩(wěn)定集中于腿部，至第 7 周達(dá)到高峰，背部和肺內(nèi)可見散在的熒光信號表達(dá)，考慮為轉(zhuǎn)移灶（圖 3和圖 4A）。

圖 4 乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長情況和荷瘤裸鼠生存情況[A：乳腺癌細(xì)胞熒光強度變化隨時間變化曲線；B：腫瘤體積隨時間生長曲線；C：移植瘤體積和熒光強度的相關(guān)性分析（r2 = 0.8563，P ＜ 0.005）；D：裸鼠的生存曲線（n = 10）]Figure 4 The growth of breast cancel cells in vivo and survival time of the nude mice bearing the tumor [A: The fluorescent intensity of MDA-MB-231SArfp cells detected by the optical imaging system changed with time; B: The tumor volume changed with time; C: The correlation analysis between tumor volume and fluorescent intensity (r2 = 0.8563, P ＜ 0.005); D: The survival time of the nude mice bearing the tumor (n = 10)]

2.4 腫瘤體積變化情況

3 周時肉眼可見腫瘤，3 ～ 4 周間腫瘤明顯生長（圖 4B），至第 6 周，6 只動物腿部都出現(xiàn)了不同程度的壞死，第 7 周時游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積可達(dá)（9.39 ± 1.15）cm3，相關(guān)性分析顯示，移植瘤體積與表示活體腫瘤細(xì)胞生長情況的熒光量子數(shù)成正相關(guān)（r2= 0.8563，P＜ 0.05）（圖 4C）。第6 周開始，由于腫瘤體積過大以及轉(zhuǎn)移的發(fā)生，荷瘤小鼠開始死亡，生存曲線見圖 4D。

2.5 X 線片和組織切片觀察結(jié)果

4 周的 X 線片即可以觀察到 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞在脛骨造成了溶骨性的骨缺損（圖5），和文獻(xiàn)[16-17]報道的時間相一致，7 周時脛骨幾乎完全破壞吸收。4 周和 7 周的 HE 染色切片在顯微鏡下都可觀察到腫瘤細(xì)胞侵襲骨質(zhì)，造成了骨質(zhì)破壞（圖 5）。

3 討論

本實驗用紅色熒光蛋白標(biāo)記的乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建了骨移植瘤裸鼠模型，Yang 等[18]認(rèn)為紅色熒光蛋白有較高的敏感性和分辨率，DsRed 的激發(fā)和發(fā)射波長較長，其發(fā)射峰位于培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)器材及細(xì)胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之外，而且DsRed 對 pH 值不敏感，pH 值為 4.5 ～ 12 時仍保持穩(wěn)定。

圖 5 乳腺癌在骨內(nèi)生長的 X 線片和組織切片觀察結(jié)果（A ～ C 為未注射腫瘤細(xì)胞的正常裸鼠；D ～ F 為注射腫瘤細(xì)胞4 周后的觀察結(jié)果；G ～ I 為注射腫瘤細(xì)胞 7 周后的觀察結(jié)果；B、E、H 為 X 線片，其中白色箭頭顯示骨缺損位置；C、F、I 為 HE 切片，黑色箭頭指示骨組織，紅色箭頭為腫瘤組織）Figure 5 The radiographic and histological analysis of the growth of breast cancer cells in bone (A - C: Acquired from normal mice without MDA-MB-231SArfp cells inoculation; D - F: Acquired from mice with MDA-MB-231SArfp cells inoculated after 4 weeks ;G - I: Acquired from mice with MDA-MB-231SArfp cells inoculated after 7 weeks; B, E, H are X-ray images with the white arrows indicated the osteolytic lesions; C, F, I are HE staining micrographs from of xenograft in tibia with red arrows indicated the tumor tissue and the black arrows indicated the bone tissue)

實驗應(yīng)用的乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 細(xì)胞株紅色熒光表達(dá)率接近 100%，信號較強，體外用G418 篩選經(jīng)過多次傳代未見有熒光衰減趨勢。本實驗建立的乳腺癌骨移植瘤裸鼠模型及其熒光影像分析研究，具有以下優(yōu)點：①敏感性：RFP 激發(fā)波長長，敏感性高，抗干擾能力優(yōu)，穿透力強，利用它建立的可視化腫瘤模型效果，與其他幾種成像模式（X 射線、CT、超聲、磁共振、核醫(yī)學(xué)）相比有更高的敏感性[8]，本實驗中活體熒光成像自注射細(xì)胞起就能持續(xù)看到熒光的表達(dá)，而肉眼要到第3 周才能觀察到腫瘤；②直觀性：實驗中只需將動物置于活體熒光成像系統(tǒng)下觀察，即可見腫瘤生長的部位、大?。虎圻B續(xù)性：傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點犧牲實驗動物以獲得數(shù)據(jù)，得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，利用活體熒光成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進(jìn)行記錄，直接觀察腫瘤的生長及跟蹤腫瘤的轉(zhuǎn)移，使實驗有很好的連續(xù)性，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信，而且大大減少了實驗所需的動物數(shù)量；④準(zhǔn)確性：本實驗中，IVIS 系統(tǒng)可以對熒光信號的強度進(jìn)行量化處理，從而可以進(jìn)行定量分析比較，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本實驗中還將活體熒光成像的數(shù)據(jù)和腫瘤體積測量、X 線片、組織學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長體積、骨質(zhì)破壞程度與乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長情況有較好的相關(guān)性。由于 X 線片能夠直觀地反映腫瘤細(xì)胞對骨質(zhì)的破壞，組織切片能在細(xì)胞水平看到腫瘤細(xì)胞與骨組織的相互作用，三者的相互結(jié)合能夠從不同的層面反映腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程，得到全面的、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，這對腫瘤的早期診斷和早期治療研究及抗癌藥物的療效評估有重要的意義。

盡管活體成像技術(shù)具有靈敏度高、操作簡單、結(jié)果直觀等優(yōu)點，但是也存在一些問題，比如在成像過程中，有些細(xì)胞（如血紅蛋白等）會發(fā)出其自身的熒光，干擾觀察結(jié)果。本實驗中，第 4、5 周觀察時，腫瘤體積相對較大，但表達(dá)熒光的腫瘤細(xì)胞仍在組織深處，所以檢測到的熒光強度相對偏弱，在第 6、7 周時，腫瘤細(xì)胞生長至皮膚表淺處，熒光信號相對較強，與腫瘤體積相一致。有研究指出，利用熒光素酶標(biāo)記的生物發(fā)光技術(shù)，在活體成像系統(tǒng)下有較強的穿透力，并能排除干擾信號，或許能彌補熒光蛋白發(fā)光的此項不足[19]。

綜上所述，本實驗成功建立了可非侵入性監(jiān)測的乳腺癌裸鼠骨移植瘤模型，可利用活體熒光成像技術(shù)對乳腺癌細(xì)胞在骨環(huán)境內(nèi)的生長情況進(jìn)行直觀、連續(xù)和定量的觀察及分析，為抗腫瘤藥物的篩選和評價提供了新的手段和工具。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):164-170

Non-invasive monitoring of the growth of breast cancer cells in bone environment using the optical imaging system

YAN Wei, JIN Fang-chun, FAN Qi-ming, TANG Ting-ting

ObjectiveTo establish the xenograft tumor model with human breast cancer cells MDA-MB-231SArfp stably expressing red fluorescent protein (RFP) and monitor the growth of breast cancer cells in bone environment using thein vivoimaging system.

MethodsMDA-MB-231SArfp cells were injected intra-tibially into BALB/c-nu female nude mice.The tumor cells growthin vivowas monitored by thein vivoimaging system and tumor volume were measured every week.Seven weeks after intra-tibial inoculation, the mice were sacrificed and hind limbs were taken out for the radiographic and histological analysis.

ResultsThe results examined by thein vivoimaging system showed that the MDA-MB-231SArfp cells started rapid growth at the 3 weeks after inoculation and the changes of fluorescent intensity correlated well with the increased tumor volume.X-ray images and HE stained tissues demonstrated that MDA-MB-231SArfp cells induced more severe osteolytic lesions at the 7 weeks than 4 weeks after inoculation.

ConclusionsWe successfuly established the non-invasive monitoring xenograft animal model using breast cancer cells labeled by the red fluorescent protein.Thein vivoimaging system, combined with radiographic and histological analysis, could provide a visualized, continuous, and reliable platform to monitor the growth of breast cancer cells in bone environment, which can used to screen and evaluate the new anti-tumor drugs.

Breast neoplasms; Disease models, animal; Diagnostic imaging; Photofluorography

TANG Ting-ting, Email: tingtingtang@hotmail.com

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(3):164-170

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.002

活體光學(xué)成像技術(shù)，包括生物發(fā)光與熒光成像技術(shù)，目前已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域發(fā)展最迅速的前沿技術(shù)。生物發(fā)光技術(shù)是以熒光素酶基因作為目的基因，將其轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞或靶器官，觀察時加入外源性熒光素底物，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫牛倮没铙w光學(xué)成像系統(tǒng)檢測[1-3]；熒光技術(shù)是采用熒光蛋白基團標(biāo)記細(xì)胞，使細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白，之后利用激發(fā)光使熒光蛋白達(dá)到較高的能量水平，然后發(fā)射出較長波長的光，最后通過活體熒光成像系統(tǒng)檢測[4-10]。應(yīng)用傳統(tǒng)的檢測方法（比如 X射線、放射性核素成像等）進(jìn)行動物實驗時，需要在不同的時間點處死實驗動物以獲得數(shù)據(jù)，缺乏連續(xù)性及整體性。相比之下，活體光學(xué)成像技術(shù)能直接監(jiān)測活細(xì)胞在動物體內(nèi)的生物學(xué)行為及跟蹤分

國家自然科學(xué)基金（81172549）；上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人計劃（11XD1403300）；上海教委重點學(xué)科建設(shè)基金（J50206）

200011 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海市骨科內(nèi)植物重點實驗室

湯亭亭，Email：tingtingtang@hotmail.com

2012-02-06子信號，是檢測實驗動物體內(nèi)細(xì)胞及分子機制的強有力手段，在當(dāng)前歐美等發(fā)達(dá)國家已被廣泛地應(yīng)用于感染、腫瘤免疫及治療、基因治療、自身免疫性疾病、藥物開發(fā)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[8,11-14]。

Author Affiliation: Department of Orthopedic Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China

·協(xié)會之窗·