以結(jié)核分枝桿菌H37Rv莽草酸脫氫酶為靶點(diǎn)的高通量篩選模型的建立及應(yīng)用

陳小娟，崔佳飛，楊延輝，關(guān)艷，張雪蓮，肖春玲

·論著·

以結(jié)核分枝桿菌H37Rv莽草酸脫氫酶為靶點(diǎn)的高通量篩選模型的建立及應(yīng)用

陳小娟，崔佳飛，楊延輝，關(guān)艷，張雪蓮，肖春玲

目的建立以結(jié)核分枝桿菌莽草酸脫氫酶為靶點(diǎn)的新型抗結(jié)核藥物高通量篩選模型；用此模型篩選莽草酸脫氫酶抑制劑；進(jìn)一步評(píng)價(jià)化合物對(duì)莽草酸脫氫酶活性的影響。

分枝桿菌，結(jié)核； 酶抑制劑； 基因表達(dá)；莽草酸脫氫酶

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(3):191-196

近幾年來結(jié)核病感染人數(shù)逐年攀升，2010 年全球結(jié)核病新增 880 萬例，中國(guó)感染結(jié)核的人數(shù)已達(dá) 1.34 億，位居世界第二，并且多藥耐藥結(jié)核（MDR-TB）日趨嚴(yán)重，同時(shí)結(jié)核病與艾滋病共感染現(xiàn)象的不斷增加，使結(jié)核病疫情的防控面臨著更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。因此開發(fā)新型的抗結(jié)核藥物迫在眉睫。

莽草酸途徑（shikimate pathway）是細(xì)菌、真菌、藻類、高等植物等合成三種必需芳香族氨基酸的必需途徑[2]，本途徑包括七步反應(yīng)，最終生成分支酸（chorismic acid）。分支酸是合成 L-色氨酸，苯丙氨酸及酪氨酸的前體物質(zhì)，同時(shí)也是合成其他芳香型化合物（諸如葉酸、泛酸和奎寧酸等）的前體物質(zhì)[3]。莽草酸脫氫酶（shikimate dehydrogenase，SD）是莽草酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化莽草酸途徑中的第四步反應(yīng)，是結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）生長(zhǎng)所必需的，SD 利用還原型輔酶 II（NADPH）催化 3-脫氫莽草酸（3-dehydroshikimate，DHS）生成莽草酸（shikimate，SKH）[4]。人體從外界環(huán)境中攝取必需芳香族氨基酸，體內(nèi)不存在莽草酸途徑，因此結(jié)核分枝桿菌莽草酸脫氫酶（MtSD）是一個(gè)很有發(fā)展前景的藥物作用靶點(diǎn)。

本研究的目的是建立基于 MtSD 抑制劑的高通量篩選（high throughput screening，HTS）模型，并用此模型篩選莽草酸脫氫酶的抑制劑，進(jìn)一步評(píng)價(jià)化合物對(duì)莽草酸脫氫酶活性的影響，為發(fā)現(xiàn)具有MtSD 抑制作用的先導(dǎo)化合物提供一種快速有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 帶有 MtSD 基因的表達(dá)工程菌BL21-pET-SD 由復(fù)旦大學(xué)王洪海實(shí)驗(yàn)室提供。恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）mc2155、海分枝桿菌（M. marinum）ATCC BAA-535、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC700603 均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）；大腸埃希菌（Escherichia coli）、銅綠色假單胞菌（p.aeruginosa）、摩氏摩根（Morganella morganii）耐藥菌、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）來自本實(shí)驗(yàn)室；甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）R6101、變形桿菌（proteusbacillus vulgaris）為本所武臨專老師實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與。

1.1.2儀器與材料 His trapTMHP 親和層析柱、AKTA 蛋白純化儀均為美國(guó) GE 公司產(chǎn)品；PCR儀、蛋白垂直電泳槽、Gel DOC 凝膠成像系統(tǒng)均為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品；EnsprireTM酶標(biāo)儀為美國(guó)Perkin Elmer 公司產(chǎn)品；LegendTMMACH1.6/R 離心機(jī)為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品；細(xì)胞壓力破碎儀AH-100B 為北京恒奧德儀器儀表有限公司產(chǎn)品；Orion Model 828 型電子 pH 計(jì)為德國(guó) Sartorius公司產(chǎn)品；MCV-B161Sb 超凈工作臺(tái)為日本SANYO 公司產(chǎn)品。

NADPH、NADP 購(gòu)自瑞士 Roche 公司；SKH購(gòu)自瑞士 Fluka 公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自美國(guó) Merck 公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自加拿大 Fermentas 公司；卡那霉素、咪唑、Tris-HCl、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；30％ 丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液、4 × 分離膠緩沖液、4 × 濃縮膠緩沖液、10 × 電泳緩沖液、R-250 考馬斯亮藍(lán)染液購(gòu)自北京普利萊公司；吐溫 80 購(gòu)自美國(guó) Amresco 公司；胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自英國(guó) Oxoid 公司；7H9 肉湯培養(yǎng)基、ADC 增菌液購(gòu)自美國(guó) BD 公司；MH肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京三藥科技開發(fā)公司；氯化鈉購(gòu)自北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1MtSD 的表達(dá)與純化 將帶有 MtSD 基因的 PET28b 載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株 BL21 得到的表達(dá)工程菌 BL21-pET-SD 劃線接種到含 50 μg/ml卡那霉素的 LB 平板上，挑取單菌落于 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)，以 1∶100 轉(zhuǎn)接于 LB 液體培養(yǎng)基（含 50 μg/ml 卡那霉素），培養(yǎng)至 OD600約為 0.6 時(shí)加入終濃度為 0.5 mmol/L 的 IPTG，37 ℃、200 r/min 誘導(dǎo)表達(dá) 5 h[5]。離心收集菌體。

1.2.2MtSD 的純化 在收集的菌體中加入裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、0.1％ 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、10 mmol/L咪唑]，液氮-冰水反復(fù)凍融 5 次[6]，再用細(xì)胞壓力破碎儀 800 bar（1 bar = 1 × 105Pa）下破碎菌體 3 遍，12 000 × g 離心 20 min 后收集上清，利用 Ni2+親和層析分離目的蛋白。先用洗脫緩沖液 A（50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、 50 mmol/L咪唑）和 B（50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑）洗脫雜蛋白，然后用洗脫緩沖液 C（50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、150 mmol/L 咪唑）洗脫目的蛋白，純化產(chǎn)物用 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)[7]。

1.2.3酶活及酶穩(wěn)定性測(cè)定 酶活測(cè)定是利用莽草酸途徑中第四步反應(yīng)的逆反應(yīng)，即SKH以NADP為輔酶在 MtSD 作用下生成 DHS。反應(yīng)于 96 孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，終體積為 100 μl。酶活測(cè)定體系包括：2 mmol/L NADP，8 mmol/L SKH，100 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.3 μg SD。在 37 ℃ 下于酶標(biāo)儀中檢測(cè) 340 nm 的吸收值（OD340）變化。酶穩(wěn)定性測(cè)定包括：處理溫度（25、37、42、55、65、75 ℃）和每個(gè)溫度的處理時(shí)間（0、5、10、20、30、40、50、60 min）。

1.2.4篩選條件優(yōu)化及高通量篩選模型的評(píng)價(jià) 優(yōu)化參數(shù)包括：反應(yīng)溫度（25，30，37，42，50 ℃），反應(yīng) pH 值（7 ～ 13，每隔 0.5 個(gè) pH 取值），反應(yīng)底物 SKH（16 ～ 0.0625 mmol/L，二倍稀釋）和 NADP 濃度（4 ～ 0.0625 mmol/L，二倍稀釋），酶量（7.77 ～ 0.68 U，二倍稀釋）及 DMSO 濃度（8％ ～ 0.125％，二倍稀釋）。Z' 因子法是評(píng)價(jià)HTS 模型穩(wěn)定性的一種重要方法。根據(jù)公式計(jì)算Z′ 因子值：Z′ = 1 － 3（SDn + SDp）/（Vn － Vp）。其中 Vn 和 SDn 分別為陰性對(duì)照孔的酶反應(yīng)速率平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；Vp 和 SDp 分別代表陽性對(duì)照孔的酶反應(yīng)速率平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5酶抑制劑高通量篩選 以優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行篩選，每塊 96 孔酶標(biāo)板上設(shè) 80 個(gè)待篩樣品孔及 4 個(gè)陽性對(duì)照孔和 4 個(gè)陰性對(duì)照孔。由于目前沒有已報(bào)道的 MtSD 酶抑制劑，本研究以加入熱變性酶（75 ℃ 處理 30 min）作為陽性對(duì)照。每孔加入待測(cè)樣品終濃度為 20 μg/ml，在 37 ℃ 條件下檢測(cè) 30 min 內(nèi)反應(yīng)體系 OD340的變化，計(jì)算酶的反應(yīng)速率。利用反應(yīng)速率計(jì)算樣品對(duì) MtSD 的抑制率（R）：R（％）=（1 － VS/VN）× 100％。其中 VS代表待測(cè)樣品孔的酶反應(yīng)速率；VN代表陰性對(duì)照孔的平均酶反應(yīng)速率。

根據(jù)以上條件，對(duì)本所化合物庫(kù)中的 5 萬余個(gè)化合物進(jìn)行了初篩，并按照初篩的反應(yīng)條件和反應(yīng)方法進(jìn)行復(fù)篩，根據(jù)復(fù)篩的結(jié)果確定化合物對(duì)MtSD 的抑制率。

1.2.6抑制劑半數(shù)抑制濃度（IC50）測(cè)定 采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件測(cè)定，化合物濃度為 160、80、40、20、10、5、2.5、0 μg/ml，計(jì)算出抑制率后使用 origin 8.1 分析各抑制劑的 IC50。

1.2.7抑制劑 6186050 對(duì)MtSD 的動(dòng)力學(xué)研究 采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，先固定 NADP 的濃度分別為 1、0.5、0.25 mmol/L，SKH 的濃度變化分別為 8、4、2、1、0.5、0 mmol/L，再固定 SKH的濃度分別為 8、4、2 mmol/L，NADP 的濃度變化分別為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 mmol/L，抑制劑 6186050 的濃度分別為 12、10、0 μg/ml，在 37 ℃ 酶標(biāo)儀中連續(xù)測(cè)定。

1.2.8抑制劑對(duì)某些臨床分離菌包括耐藥菌株的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 于 96 微孔板中進(jìn)行，海分枝桿菌和恥垢分枝桿菌用 7H9 培養(yǎng)基，其他細(xì)菌用 MH 培養(yǎng)基，抑制劑的終濃度分別為128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 μg/ml，用 MH 肉湯培養(yǎng)基或 7H9 培養(yǎng)基（含 10％ ADC）二倍稀釋成各種所需濃度，實(shí)驗(yàn)菌的接種量約為 5 × 105 cfu/ml，稀釋菌液于15 min 內(nèi)接種完畢。接種恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌時(shí)，需在 7H9 培養(yǎng)基（含 10％ ADC）中加入0.05％ 的吐溫 80。除糞腸球菌 37 ℃ 孵育 24 h和海分枝桿菌 30 ℃ 孵育 4 d 外[8]，其他菌株都是37 ℃ 孵育 18 h 觀察結(jié)果[9]。

2 結(jié)果

2.1 MtSD 的表達(dá)和純化

對(duì)表達(dá)純化得到的MtSD 蛋白進(jìn)行 SDSPAGE 分析，相對(duì)分子質(zhì)量約為 29 kD。雖然大部分表達(dá)的MtSD 蛋白在沉淀中，但上清經(jīng)純化后在SDS-PAGE 上也看到明顯的目的條帶，并且條帶是單一的（圖 1）。

圖1 MtSD SDS-PAGE 圖譜Figure 1 SDS-PAGE of expressed and purifiedMtSD protein

2.2 酶活測(cè)定

在MtSD 的作用下 SKH 苯環(huán)上的 3 位脫去一個(gè)氫離子轉(zhuǎn)移到 NADP 上，生成NADPH，通過檢測(cè)體系中的 NADPH 的濃度來反映MtSD 的酶活。NADPH 的濃度與OD340 成線性關(guān)系（圖 2）。

MtSD 酶活力的定義：37 ℃ 條件下反應(yīng)，每分鐘催化生成 1 nmol/L NADPH 的酶量設(shè)定為1 U。純化后MtSD 為 0.272 mg/ml，酶比活力為20987 U/mg。并且酶反應(yīng)速率與酶量成線性關(guān)系（圖 3）。

圖2 NADPH 濃度與OD340 關(guān)系Figure 2 The relationship between the concentration of NADPH andOD340

圖3 酶量與反應(yīng)速度關(guān)系Figure 3 The relationship between the quantity and raction rate ofMtSD

圖4 MtSD 穩(wěn)定性Figure 4 The stability ofMtSD

2.3 酶穩(wěn)定性測(cè)定

MtSD 在 25、37、42 ℃ 處理 1 h 內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)；55 ℃ 時(shí)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)酶活逐漸下降；65 ℃ 處理 40 min 后、75 ℃ 處理 20 min 后MtSD 已失活（圖 4）。

2.4 篩選條件優(yōu)化和高通量篩選模型的評(píng)價(jià)

隨著溫度的升高M(jìn)tSD 反應(yīng)速度增加，為便于實(shí)驗(yàn)的操作，選擇 37 ℃ 為篩選溫度；體系中 pH值為 12 時(shí)酶活力達(dá)到最大，但此時(shí)反應(yīng)體系不穩(wěn)定，故篩選的 pH 值確定為 9；最佳 SKH 濃度為8 mmol/L；最佳 NADP 濃度為 1 mmol/L；最佳酶量為 0.3 μg，即 2.5 U；DMSO 在 ≥ 0.5％ 時(shí)對(duì)MtSD 活力產(chǎn)生影響，因此在篩選時(shí)陰性對(duì)照和空白對(duì)照必須加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的 DMSO，消除DMSO 對(duì)酶活造成的影響（圖 5）。

圖5 篩選條件優(yōu)化（A：最適溫度；B：最適 pH；C：最佳 SKH 濃度；D：最佳 NADP 濃度；E：最佳酶量；F：DMSO濃度對(duì)酶活的影響）Figure 5 Optimization of screening conditions (A: Optimization of temperature; B: Optimization of pH; C: Optimization of the SKH concentration; D: Optimization of the NADP concentration; E: Optimization of the enzyme concentration; F: Effect of the DMSO concentration)

目前廣泛使用的 HTS 模型的穩(wěn)定性和可靠性評(píng)估參數(shù)是Z′ 因子[10]，它是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，與篩選源無關(guān)，僅與篩選方法本身有關(guān)。一般認(rèn)為，如果 1 ＞Z′ ＞ 0.5，說明該篩選模型是比較理想的適合于 HTS 的方法；如果Z′ ＜ 0.5，則說明篩選方法還需要調(diào)整。本實(shí)驗(yàn)中 HTS 的Z' 因子值為0.76 ± 0.04。因此，所建立的篩選方法是一種穩(wěn)定性和靈敏度都較好的 HTS 方法。

2.5 MtSD 抑制劑的篩選及 IC50

采用建立的 HTS 篩選模型，對(duì)本所 5 萬余個(gè)化合物進(jìn)行篩選，得到 9 個(gè)抑制率 ＞ 20％ 的化合物，并分別測(cè)定它們的 IC50?；衔锞幪?hào)、對(duì)MtSD的抑制率及 IC50如表 1。

2.6 抑制劑 6186050 對(duì)MtSD 的動(dòng)力學(xué)研究

由于抑制劑 6186050 的 IC50相對(duì)較低，對(duì)其動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。NADP 為 1 mmol/L 時(shí)，抑制劑6186050 以競(jìng)爭(zhēng)的方式抑制MtSD 的活性（圖 6），抑制常數(shù)Ki為 4.9 μmol/L。

2.7 抑制劑對(duì)某些臨床分離菌包括耐藥菌株的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

經(jīng)過 3 次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，具有抑菌活性的抑制劑對(duì)菌株的 MIC 如表 2 所示。

表1 各活性化合物對(duì)MtSD 抑制率及 IC50Table 1 The inhibition ratio of active compoundsfor recombinantMtSD and IC50

圖6 抑制劑 6186050 動(dòng)力學(xué)Figure 6 The kinetics of inhibitor 6186050

表2 抑制劑對(duì)菌株的 MICTable 2 The MIC of inhibitors to bacterial strains

3 討論

MtSD 是 MTB 莽草酸代謝途徑中關(guān)鍵酶，重組工程菌 37 ℃ IPTG 誘導(dǎo)和 20 ℃ 自誘導(dǎo) 24 h后，大部分表達(dá)的MtSD 蛋白都以包涵體的形式存在，對(duì)其氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)序列中具有三個(gè)半胱氨酸，因而在大腸桿菌中表達(dá)很容易由于不正確折疊而形成包涵體。查閱相關(guān)的文獻(xiàn)[5-6]后，確立使用反復(fù)凍融 5 次再壓力破碎的方法裂解菌體，可使菌體中可溶性的MtSD 得到充分釋放，另外在裂解緩沖液中加入 0.1％ 的 Triton 能提高可溶性MtSD 的產(chǎn)量。對(duì)純化過程中的各組分進(jìn)行收集，發(fā)現(xiàn)柱子流穿液和雜峰洗脫液中都能檢測(cè)到MtSD活性，離心沉淀不具有活性，說明MtSD 跟 His 親和柱結(jié)合能力不強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物 NADPH 的吸收特性對(duì)MtSD 蛋白的活性進(jìn)行測(cè)定，通過對(duì)反應(yīng)體系的溫度、pH、底物濃度、酶量、DMSO 等條件的優(yōu)化，建立了MtSD 抑制劑的 HTS篩選模型，其Z′ 因子值達(dá)到了0.76 ± 0.04。通過對(duì)本所 5 萬余個(gè)化合物進(jìn)行篩選，表明該模型快速、靈敏、穩(wěn)定等特點(diǎn)，為尋找和發(fā)現(xiàn)MtSD抑制劑提供了一種新的技術(shù)和方法。

對(duì) Helen A. Arcuri 同源模建的MtSD 結(jié)構(gòu)分析，NADPH 結(jié)合的區(qū)域在 N 端，其催化區(qū)域分布在 C 端，并且 NADPH 的結(jié)合對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)變化不大[11]，抑制劑 6186050 與NADPH 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，因此抑制劑 6186050 與MtSD 相互作用后可能對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生太大影響，當(dāng)然這還需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。抑制劑 6230384 和 6186050 對(duì)海分枝桿菌的 MIC都是 32 μg/ml，MTB 和海分枝桿菌的SD 酶（YP_001850477.1）的同源性高達(dá) 83％，而且海分枝桿菌在遺傳上是與 MTB 關(guān)系最近的：基因組序列有 85％ 與 MTB 具有同源性[12]，這些抑制劑的抗結(jié)核活性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

志謝感謝上海復(fù)旦大學(xué)王洪海老師實(shí)驗(yàn)室提供的 SD 表達(dá)工程菌株。

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Establishment and application of a high-throughput screening model targeting to shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv

CHEN Xiao-juan, CUI Jia-fei, YANG Yan-hui, GUAN Yan, ZHANG Xue-lian, XIAO Chun-ling

ObjectiveTo establish a high-throughput screening (HTS) model targeting Mycobacterium tuberculosis shikimate dehydrogenase (MtSD) for the discovery of novel antituberculosis drugs. The established model was used to screen inhibitors targeting MtSD and to explore the effects of compounds on the activity of SD.MethodsAfter expression and purification, MtSD activity was measured by detecting the absorption of NADPH at 340 nm wavelength in solution. HTS was established based on the activity of SD and Z' factors were used to evaluate the quality of the HTS model. 50 000 compounds were screened by using this model and IC50of inhibitors were determined, besides the enzyme kinetics of inhibitor 6186050 was investigated. Some bacterial strains segregated from clinical were evaluated for the effect of inhibitors by the method of diluting liquid.ResultsRecombinant MtSD was successfully obtained and has the optimal activity 20987 U/mg. The parameter Z' factor was 0.76. It was suggested that the model was highly feasible and stable for HTS drug screening. 9 compounds were found to inhibit MtSD using the HTS model, and the inhibitory effect of inhibitor 6185020 on the activity of SD was reversible. Both of the MIC of inhibitors 6230384 and 6186050 were 32 μg/ml for Mycobacterium marinum.ConclusionA steady and sensitive HTS model for potential MtSD inhibitors was established. The hits of MtSD inhibitors possess bacteriostasis activity.

Mycobacterium tuberculosis; Enzyme inhibitors; Gene expression; Shikimate dehydrogenase

s:ZHANG Xue-lian, Email: xuelianzhang@fudan.edu.cn; XIAO Chun-ling, Email: xiaoc1318@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.006

“重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)（2008ZX10003-006）

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國(guó)家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室（陳小娟、崔佳飛、楊延輝、關(guān)艷、肖春玲）；200433 上海，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳所遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張雪蓮）

張雪蓮，Email：xuelianzhang@fudan.edu.cn；肖春玲，Email：xiaoc1318@163.com

2012-02-24

方法表達(dá)并純化結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 莽草酸脫氫酶；利用還原型輔酶 II（NADPH）在溶液中的光吸收，測(cè)定酶的活性，構(gòu)建了該酶抑制劑的高通量篩選模型；用 Z′ 因子法評(píng)價(jià)該模型的可靠性，并對(duì) 5 萬余個(gè)化合物進(jìn)行篩選；測(cè)定了各抑制劑的 IC50并對(duì)抑制劑 6186050 的酶抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究；用菌液稀釋法評(píng)價(jià)了抑制劑對(duì)某些臨床分離菌株包括耐藥菌株的影響。

結(jié)果得到了重組莽草酸脫氫酶；測(cè)得比活力為 20987 U/mg，所建的莽草酸脫氫酶高通量篩選模型 Z′ 因子為 0.76，符合高通量篩選的要求；對(duì) 5 萬余個(gè)化合物進(jìn)行篩選得到 9 個(gè)抑制率較高的化合物；抑制劑 6186050 為競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制劑；抑制劑 6230384 和 6186050 對(duì)海分枝桿菌的最低抑菌濃度（MIC）都是 32 μg/ml。

結(jié)論建立了穩(wěn)定性好、靈敏度較高的結(jié)核分枝桿菌莽草酸脫氫酶抑制劑高通量藥物篩選模型，應(yīng)用該模型篩選得到的抑制劑可能具有抑菌活性。

Author Affiliations:National Laboratory for Screening New Microbial Drugs, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union medical college, Beijing 100050, China (CHEN Xiao-juan, CUI Jia-fei, YANG Yan-hui, GUAN Yan, XIAO Chun-ling); State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China (ZHANG Xue-lian)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):191-196