遞增負(fù)荷有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡雌性大鼠心肌抗氧化酶及心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

雷志軍，鄭 瀾，凡 婷，陳伊琳，林麗容

心臟結(jié)構(gòu)和功能的增齡改變是心臟病發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，這類疾病已嚴(yán)重影響中老年人群的健康和生存質(zhì)量。衰老的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為，自由基是導(dǎo)致機(jī)體衰老的主要原因，并可導(dǎo)致與衰老相關(guān)疾病的發(fā)生[1]。已有研究表明，適宜的運(yùn)動(dòng)能提高機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶活性，延緩衰老[2,3]。線粒體是ATP和自由基生成的主要場(chǎng)所，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變是其功能改變的可見形式，對(duì)線粒體形態(tài)學(xué)的研究能彌補(bǔ)酶的生化測(cè)定的不足[4]。本研究探討規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡大鼠心肌抗氧化酶活性和線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，旨在說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟自然衰老過(guò)程中心肌增齡改變的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

健康雌性18月齡Sprague-Dawley大鼠30只，體重460.5g±59.3g(由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供)，隨機(jī)分為2組：老齡運(yùn)動(dòng)組和老齡對(duì)照組，每組15只；另安排一組3月齡Sprague-Dawley大鼠為年青對(duì)照組(取材時(shí)臨時(shí)購(gòu)進(jìn))，體重約為180.4 g±46.5 g，共10只。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，室溫23℃±2℃，相對(duì)濕度55%±5%，自然光照。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均未進(jìn)行過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.2 訓(xùn)練方案

大鼠經(jīng)適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)后，采用遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，起始速度為15m/min，時(shí)間為15min，以后按照先增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間再增加運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的原則依次進(jìn)行遞增，運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加幅度為5min，跑速增加幅度為1m/min，每一負(fù)荷持續(xù)時(shí)間為一周，每周訓(xùn)練6次，最后兩周運(yùn)動(dòng)負(fù)荷維持不變，直至本實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每天下午4點(diǎn)30開始運(yùn)動(dòng)，星期天休息。

1.3 取材和指標(biāo)的測(cè)定

訓(xùn)練結(jié)束后12h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)大鼠用1%戊巴比妥鈉按50mg/Kg深度麻醉，暴露胸腔，迅速取出心臟，浸入4℃生理鹽水中洗凈殘余血液，剔除心包和心外膜，用小剪刀剪碎，置液氮中貯存?zhèn)溆?。每組隨機(jī)抽取三只實(shí)驗(yàn)大鼠，在心尖部取一小份心肌組織(1mm左右)，置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液，用于制備電鏡檢測(cè)標(biāo)本。

1.3.1生化指標(biāo)測(cè)定心肌組織塊常溫解凍，濾紙拭干，取心肌組織(0.2g～1g)濾紙吸干，加入液氮碾磨成白色粉末，用0.86%冷生理鹽水，制備成10%心肌組織勻漿液，震蕩混勻。以2 500r/min速度4℃離心10min，取上清液分別用于丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX-Px) 的測(cè)定。MDA、SOD、CAT 和GPX-Px酶試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行操作。

1.3.2電鏡標(biāo)本制取取出的心肌組織用2.5%戊二醛磷酸緩沖液預(yù)固定，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗三次，1%鋨酸緩沖液后固定，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗三次，丙酮逐級(jí)梯度脫水，環(huán)氧樹脂(Epon) 812包埋，半薄切片光學(xué)定位，然后制成超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色。用日立(HITACHI)H-7500透射電子顯微鏡20 000倍下觀察，德國(guó)奧林巴斯CCD系統(tǒng)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠心肌抗氧化酶活性的影響

老齡運(yùn)動(dòng)組大鼠較老齡安靜組大鼠心肌SOD、GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)，老齡對(duì)照組大鼠心肌SOD、GSH-Px活性較年青對(duì)照組大鼠顯著下降(P<0.01)；老齡對(duì)照組大鼠CAT較年青對(duì)照組大鼠存在顯著降低(P<0.05)，老齡運(yùn)動(dòng)大鼠與老齡對(duì)照大鼠CAT活性無(wú)顯著性差異(見表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織氧化抗氧化能力測(cè)試結(jié)果

注：與年青對(duì)照組大鼠比較，“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01；與老齡對(duì)照組大鼠比較，“#”表示P<0.05；“##”表示P<0.01。

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠心肌MDA含量的影響

老齡運(yùn)動(dòng)組大鼠較老齡對(duì)照組大鼠MDA含量顯著下降(P<0.05)，老齡對(duì)照組大鼠較年青對(duì)照組大鼠MDA含量顯著下降(P<0.01)(見表1)。

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠心肌線粒體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

年青對(duì)照組大鼠心肌線粒體排列有序，線粒體完整性好，未見空泡或腫脹(見圖1A)；老齡對(duì)照組大鼠心肌線粒體出現(xiàn)內(nèi)室腫脹，表現(xiàn)為不同程度的空化，部分出現(xiàn)灶性空化，嵴減少，形成較寬的電子透亮區(qū)，個(gè)別線粒體因高度腫脹出現(xiàn)界膜破裂、線粒體崩解(見圖1B)；老齡運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌線粒體少數(shù)出現(xiàn)較小內(nèi)室腫脹，但未見界膜破損(見圖1C)。

A：年青對(duì)照組大鼠心肌線粒體排列有序，線粒體膜完整(20 000)；B：老齡對(duì)照組大鼠心肌線粒體內(nèi)室有不同程度空化，膜可見破裂(20 000)；C：老齡運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌線粒體內(nèi)室有較小腫脹，膜未見破裂(20 000)

圖1大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

3 分析與討論

心臟主要通過(guò)有氧代謝供能，是機(jī)體中耗氧率最高的器官之一。心肌線粒體氧化供能的同時(shí)也釋放出自由基，構(gòu)成線粒體電子傳遞鏈中必須的中間環(huán)節(jié)。SOD是機(jī)體主要的抗氧化酶。本研究發(fā)現(xiàn)，老齡運(yùn)動(dòng)大鼠心肌中SOD較老齡不運(yùn)動(dòng)大鼠的顯著提高，表明在有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)刺激下，機(jī)體自由基含量增多，誘導(dǎo)性地增加了心肌中SOD的活性。SOD活性增強(qiáng)不僅有利于機(jī)體及時(shí)清除O2·-，避免O2·-對(duì)細(xì)胞膜的損傷或者透過(guò)細(xì)胞膜上的陰離子通道，對(duì)細(xì)胞核也能造成進(jìn)一步的損害[5]。CAT和GSH-Px同為清除H2O2的酶，老齡運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌GSH-Px活性增強(qiáng)，而CAT沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變，表明運(yùn)動(dòng)中心肌H2O2的清除主要由GSH-Px發(fā)揮抗氧化作用，這可能是因?yàn)樵谡４髿鈮貉跸翯SH-Px的活性最高，比SOD高1 478倍，比CAT高36倍，與這兩種酶的生物活性有關(guān)[6]。MDA含量出現(xiàn)隨齡增多的趨勢(shì)，表明機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化加重。運(yùn)動(dòng)組老齡大鼠相比安靜組老齡大鼠心肌MDA含量下降，說(shuō)明規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能有效降低心肌脂質(zhì)過(guò)氧化程度。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化、儲(chǔ)能和供能的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，其產(chǎn)生的ROS占機(jī)體ROS總量的90%以上[7]。線粒體結(jié)構(gòu)的完整是其功能正常發(fā)揮的保障，線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，如腫脹、脊斷裂和空泡化等，可引起線粒體能量代謝失衡，ATP酶活性發(fā)生改變，鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)等系列功能的變化[8]。線粒體腫脹通常被看作是細(xì)胞損傷或老化的表現(xiàn)，而線粒體崩解則是細(xì)胞衰老變化的重要標(biāo)志[4]。運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體耗能大幅增加是導(dǎo)致其超微結(jié)構(gòu)改變的重要原因[10]。本研究結(jié)果顯示，老齡大鼠與年青大鼠相比，心肌線粒體膜破損，線粒體嵴減少、斷裂，而規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能使線粒體隨增齡的超微結(jié)構(gòu)改變得到改善。線粒體膜和嵴的完整性能提高能量轉(zhuǎn)換的效益，保持線粒體呼吸鏈的通暢，避免因呼吸鏈活性受阻引起ROS生成進(jìn)一步增多和積聚，從而引起線粒體內(nèi)膜氧化損傷，降低膜流動(dòng)性、導(dǎo)致膜脂質(zhì)降解等。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)組老齡大鼠心肌線粒體較不運(yùn)動(dòng)對(duì)照組老齡大鼠完整性好、損傷程度低，這可能是長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)提高心肌抗氧化酶活性，減少ROS對(duì)線粒體膜的損傷，是適宜運(yùn)動(dòng)延緩心肌衰老的表現(xiàn)之一。

4 結(jié)論

(1)長(zhǎng)期有規(guī)律地進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)，能提高老齡大鼠心肌抗氧化酶活性，降低老齡運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌MDA含量，保護(hù)心肌組織因衰老而導(dǎo)致的自由基的損害，延緩心肌衰老。

(2)長(zhǎng)期有規(guī)律地進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)，能改善老齡大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)，保護(hù)線粒體膜和嵴的完整性，延緩心肌線粒體因衰老而導(dǎo)致的退行性變化。

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