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    人骨髓胚胎樣干細(xì)胞向多核肌纖維誘導(dǎo)分化的研究*

    2012-01-30 03:58:50龐榮清張永云阮光萍朱向情王利民潘興華
    中國病理生理雜志 2012年6期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液骨髓胚胎

    龐榮清, 張永云,2△, 阮光萍, 朱向情,2, 何 潔, 趙 晶, 王利民, 潘興華, 張 成

    (1成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院干細(xì)胞與組織器官工程研究中心,云南昆明650032;2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,云南昆明650201;3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東廣州510080)

    肌營養(yǎng)不良癥等肌病的治療目前尚無有效手段。干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展雖然為此帶來了新的希望,但療效尚需進(jìn)一步提高。其中,種子細(xì)胞的選擇是影響干細(xì)胞治療效果的關(guān)鍵因素之一[1]。

    研究證實(shí):成體骨髓中存在表達(dá)胚胎干細(xì)胞抗原標(biāo)志的干細(xì)胞,如多潛能成體祖細(xì)胞(multipotential adult progenitor cells)[2]、骨髓來源成體多潛能誘導(dǎo)細(xì)胞(bone marrow-derived adult multilineage inducile cells)[3]和很小胚胎樣干細(xì)胞(very small embryonic - like stem cells,VSELs)[4],在早期的文獻(xiàn)中這類細(xì)胞的名稱不同,近年來的文獻(xiàn)[5-7]中逐漸使用胚胎樣干細(xì)胞(embryonic-like stem cells,ELSCs)的命名。本研究根據(jù)Battula等[8]的方法,從骨髓中分離 ELSCs,然后開展了體外成肌分化實(shí)驗(yàn)研究,旨在為探索理想的肌病治療種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

    材料和方法

    1 主要試劑

    成肌分化誘導(dǎo)試劑盒(SKGM-2 Kit,Lot No.CC-3245)購自 Lonza;明膠和2-mercaptoethanol購自 Sigma;DMEM/F12購自HyClone;Knockout-DMEM、血清替代物(serum replacement,SR)、glutamine、非必需氨基酸(non - essential amino acids,NEAA)、新生牛血清(newborn cattle serum,NCS)、FITC -goat-anti-rabbit IgG、FITC -rabbit-anti-goat IgG 和4',6-二脒基 -2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)均購自Invitrogen;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)購自 Cell Systems;免疫染色用Ⅰ抗[rabbit-anti-h(huán)uman Oct-4、Nanog-3、MyoD,goat-anti-h(huán)uman Sox-2和mouse-anti-h(huán)uman成肌素(myogenin)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)]購自Santa Cruz;Ⅱ抗HRP-conjugated rabbit/mouse antibody購自Gene;所用引物(表1)和RT-PCR試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

    2 主要方法

    2.1 ELSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分離培養(yǎng) 參照Battula等[8]的方法,密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到事先用明膠包被過的培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)以分離擴(kuò)增ELSCs。無血清培養(yǎng)基是添加了20%SR、2 mmol/L L - glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 - mercaptoethanol和5 μg/L bFGF的Knockout-DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)瓶的包被:每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入5 mL 0.1%明膠溶液室溫條件下靜置30 min,然后吸棄明膠溶液于室溫條件下風(fēng)干即可。作為對(duì)照,用含血清培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到未包被的培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)以分離擴(kuò)增MSCs。含血清培養(yǎng)基為含10%NCS的DMEM/F12培養(yǎng)液。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況并拍照。每4 d換液,到細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)時(shí),用trypsin/EDTA消化傳代細(xì)胞。取第2代細(xì)胞作細(xì)胞爬片行Oct-4、Nanog-3和Sox-2的免疫熒光染色。

    2.2 體外成肌分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 消化收集生長良好的第4代ELSCs,用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,6孔板中事先放置明膠包被的蓋玻片,按照2×104cells/well接種細(xì)胞到蓋玻片上于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使其貼壁后,吸棄無血清培養(yǎng)基,換為試劑盒提供的成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。按照相應(yīng)的培養(yǎng)方案和細(xì)胞密度,消化收集生長良好的第4代MSCs,用含血清培養(yǎng)基使其貼壁生長后,吸棄含血清培養(yǎng)基,換為上述成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。適時(shí)換液,取細(xì)胞爬片,用4%多聚甲醛固定后,免疫染色檢測(cè)肌細(xì)胞抗原標(biāo)志MHC、MyoD和myogenin的表達(dá)。采用相同的方法,第4代ELSCs和MSCs培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞貼壁后,換為上述成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng),消化收集細(xì)胞作RT-PCR分析。為了比較2種細(xì)胞的成肌分化效率,根據(jù)方法[9]計(jì)算樣品的成肌分化效率,每個(gè)細(xì)胞爬片計(jì)數(shù)6個(gè)視野。計(jì)算公式:成肌分化效率=MHC陽性肌纖維數(shù)/計(jì)數(shù)的總細(xì)胞數(shù)目。

    2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將各組細(xì)胞用PBS清洗之后,用4%甲醛固定10 min,再用0.5%Triton X-100破膜處理10 min。然后用PBS清洗3遍,加入封閉液室溫條件下作用10 min,免疫熒光染色細(xì)胞滴加Ⅰ抗(rabbit-anti-h(huán)uman Oct-4、Nanog-3和 goat-anti-h(huán)uman Sox-2),4 ℃避光孵育10 h,PBS漂洗1次以去除未結(jié)合的Ⅰ抗,滴加Ⅱ抗(FITC-goat-anti-rabbit IgG或 FITC-rabbit-anti-goat IgG)于室溫條件下避光孵育30 min,再滴加DAPI于室溫條件下避光孵育5 min,PBS漂洗去除未結(jié)合的Ⅱ抗和DAPI。PBS替代Ⅰ抗染色作為陰性對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察拍照。非免疫熒光染色細(xì)胞滴加Ⅰ抗(rabbit-anti-h(huán)uman MyoD和mouse-anti-h(huán)uman myogenin、MHC),4 ℃孵育10 h,PBS漂洗1次以去除未結(jié)合的Ⅰ抗,滴加Ⅱ抗 HRP-conjugated rabbit/mouse antibody于室溫條件下孵育30 min,PBS漂洗去除未結(jié)合的Ⅱ抗。PBS替代Ⅰ抗染色作為陰性對(duì)照。生物顯微鏡下觀察并用 ×10或 ×20攝取。每組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)都會(huì)采集超過30個(gè)區(qū)域的細(xì)胞。

    2.4 RT-PCR 采用Trizol提取總RNA,分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度,取5 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA。參照RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明檢測(cè)myogenin、MHC和MyoD mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增條件為:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min,94 ℃ 初始化 4 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,45個(gè)循環(huán),72℃ 7 min。GAPDH用作內(nèi)參照控制。不加cDNA的反應(yīng)設(shè)為對(duì)照。取擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL,加上樣緩沖液2.0 μL,在1%瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠圖像成像系統(tǒng)拍照。

    Figure 1.Morphological characterization of ELSCs and MSCs under light microscope(×40).A:primary ELSCs appeared small,morphologically slenderer and of homogeneous shape;B:primary MSCs showed different morphologies including spindle-shaped,epithelioid,polygonal or round shape.圖1 ELSCs和MSCs的形態(tài)特征

    Figure 2.Expression of multipotential markers ELSCs and MSCs.A:weak expression of Oct- 4 in ELSCs;A1:magnification of A;B:weak expression of Nanog-3 in ELSCs;B1:magnification of B;C:weak expression of Sox-2 in ELSCs;C1:magnification of C;D:no expression of Oct-4 in MSCs;E:no expression of Nanog-3 in MSCs;F:no expression of Sox - 2 in MSCs.A,B,C,D,E,F(xiàn):× 100;A1,B1,C1:×200.圖2 多潛能抗原標(biāo)志在ELSCs和MSCs的表達(dá)

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 ELSCs和MSCs的分離擴(kuò)增

    采用無血清培養(yǎng)基(含20%SR、2 mmol/L L-glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 -mercaptoethanol和5 μg/L bFGF 的knockout-DMEM培養(yǎng)液)在明膠包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以分離到ELSCs。采用有血清培養(yǎng)基(含10%NCS的DMEM/F12培養(yǎng)液)在未包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)相同的骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以分離到MSCs。在倒置相差顯微鏡下可見這2種細(xì)胞形態(tài)存在明顯差別。ELSCs體積較小、形態(tài)纖細(xì)均一,見圖1A。MSCs體積較大,常包括紡錘形、多邊性和圓形等多種細(xì)胞形態(tài),見圖1B,傳代后變得均一。免疫熒光染色顯示:采用無血清培養(yǎng)基擴(kuò)增的第2代ELSCs能檢測(cè)到多潛能抗原標(biāo)志Oct-4、Nanog-3和Sox-2的微弱表達(dá),見圖2A、A1、B、B1、C、C1,而采用經(jīng)典方法擴(kuò)增的 MSCs沒有檢測(cè)到這些抗原標(biāo)志的表達(dá),見圖2D、E、F。

    2 體外成肌誘導(dǎo)分化

    由Lonza公司生產(chǎn)的成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液由100 mL skeletal muscle growth medium、10 mL fetal bovine serum、2 mL glutamine、0.1 mL重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)、0.1 mL dexamethasone 和 0.1 mL gentamicin sulfate amphotericin-B組成。貼壁生長的第4代ELSCs和MSCs在此誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3 d即可檢測(cè)到少量MHC蛋白陽性表達(dá),10 d左右檢測(cè)到大量MHC陽性細(xì)胞,第12 d后MHC陽性細(xì)胞減少。提示:10 d是最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間。免疫染色結(jié)果顯示:誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的第4代ELSCs和MSCs均可檢測(cè)到大量MHC和mygenin陽性的多核肌纖維,見圖3,形態(tài)特征非常典型。RT-PCR分析結(jié)果證實(shí):誘導(dǎo)10 d的ELSCs和MSCs表達(dá)了MHC和myogenin mRNA,見圖4。但沒有檢測(cè)到MyoD在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。作為對(duì)照,不在成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ELSCs和MSCs都檢測(cè)不到肌細(xì)胞特異性標(biāo)志抗原MHC、myogenin和MyoD的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的ELSCs的成肌分化率為(25.7±4.1)%,明顯高于MSCs(15.8±7.6)%,差異顯著(P<0.05)。

    Figure 3.Expression of muscle-specific markers in ELSCs and in MSCs cultured in myogenic differentiation medium for 10 d.A:expression of MHC in ELSCs;B:expression of MHC in MSCs;C:three nucleated fibers;D:multinucleated fibers;E:expression of myogenin in ELSCs;F:magnification of E;G:expression of myogenin in MSCs;H:magnification of G;I:no expression of MyoD in MSCs;J:no expression of MyoD in ELSCs.A,E,G,I,J:×40;B,F(xiàn),H:×100;C,D:×400.圖3 在成肌誘導(dǎo)液中培養(yǎng)10 d的ELSCs和MSCs肌細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志的表達(dá)

    Figure 4.The RT-PCR results for mRNA expression of muscle-specific markers in ELSCs and in MSCs cultured in myogenic differentiation medium for 10 d.M:2 000 bp DNA marker;1:myogenin expression in MSCs;2:myogenin expression in ELSCs;3:negative control for myogenin;4:MHC expression in MSCs;5:MHC expression in ELSCs;6:negative control for MHC;7:no expression of MyoD in MSCs;8:no expression of MyoD in ELSCs;9:no expression of MHC in noninduced ELSCs;10:GAPDH expression in MSCs.圖4 肌細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志基因在誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的ELSCs和MSCs表達(dá)的RT-PCR結(jié)果

    討 論

    1 ELSCs的分離擴(kuò)增

    Battula等[8]采用胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法從骨髓中分離到表達(dá)多潛能干細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞,并證明這些細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)向脂肪、骨、胰島細(xì)胞分化。按照該方法,本研究采用無血清培養(yǎng)基(含20%SR、2 mmol/L L-glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 - mercaptoethanol和 5 μg/L bFGF 的Knockout-DMEM培養(yǎng)液)從成體骨髓中分離到形態(tài)纖細(xì)均一的SLECs,與運(yùn)用傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基分離到的MSCs在形態(tài)上具有明顯區(qū)別,而且ELSCs微弱表達(dá)多潛能抗原標(biāo)志Oct-4、Nanog-3和 Sox-2,與 Battula等[8]的結(jié)果一致。無血清培養(yǎng)基一直是用來擴(kuò)增人胚胎干細(xì)胞的專用培養(yǎng)基,牛血清的加入將導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞的分化[10]。運(yùn)用胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增方法來擴(kuò)增骨髓干細(xì)胞是個(gè)很有創(chuàng)意的思路。其他學(xué)者的研究[5]也證明采用含EGF等細(xì)胞因子的無血清培養(yǎng)基可從臍血中分離到體積較小的ELSCs。這些研究均支持了成體組織中存在ELSCs的觀點(diǎn)。成體組織中存在的ELSCs,多數(shù)學(xué)者[6,11-12]認(rèn)為是胚胎發(fā)育過程中遺留下來的原始干細(xì)胞,這些干細(xì)胞因印記基因的表觀遺傳改變而處于靜息狀態(tài),是組織器官再生的備份細(xì)胞,對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。bFGF是維持人胚胎干細(xì)胞自我更新而不分化的強(qiáng)刺激因子[13],也是維持造血干細(xì)胞長期保持增殖能力的重要因子[14]。本研究中ELSCs很可能就是骨髓中極少數(shù)原始干細(xì)胞擴(kuò)增的結(jié)果。

    2 ELSCs的成肌誘導(dǎo)分化

    5-氮雜胞苷通常用作干細(xì)胞的成肌分化誘導(dǎo)劑[15-16],其作用機(jī)制一直被認(rèn)為是由于DNA甲基化導(dǎo)致成肌調(diào)節(jié)因子的激活[17]。由于DNA的甲基化可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變,因此,含有5-氮雜胞苷的培養(yǎng)液并不適于干細(xì)胞誘導(dǎo)。此外,有報(bào)道顯示5-氮雜胞苷不能誘導(dǎo)人骨髓來源的MSCs分化形成肌管[9,18]。在本研究中,采用添加了rhEGF而不含有5-氮雜胞苷的成肌分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)ELSCs和MSCs 3 d,即可將2種細(xì)胞誘導(dǎo)為多核肌纖維,細(xì)胞呈長條狀,具有多個(gè)細(xì)胞核,完全符合肌纖維的典型特征,表明不含5-氮雜胞苷的肌細(xì)胞生長培養(yǎng)液是一種安全高效的成肌分化誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)10 d的細(xì)胞MHC表達(dá)率最高,這個(gè)結(jié)果其實(shí)反映了肌管形成的規(guī)律,即肌細(xì)胞相互融合形成多核肌管,肌管具有自發(fā)收縮功能而從培養(yǎng)瓶中脫落,因此隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長,免疫染色就檢測(cè)不到陽性表達(dá)的脫落細(xì)胞。有趣的是,有報(bào)道結(jié)果顯示由于rhEGF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,因此rhEGF的存在會(huì)負(fù)調(diào)控干細(xì)胞的成肌分化[19]。很顯然,本研究中rhEGF的存在并沒有影響細(xì)胞的成肌分化,可能原因包括:(1)分離擴(kuò)增的培養(yǎng)體系不同,導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)中所用的干細(xì)胞生物學(xué)特性差異很大,其成肌分化結(jié)果自然也就不相同;(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)體系組成成分不同,誘導(dǎo)結(jié)果可能就不相同;(3)rhEGF的作用機(jī)制復(fù)雜,不同時(shí)點(diǎn)加入,單獨(dú)使用或與其它因子聯(lián)合使用的結(jié)果不同甚至相反都是可能的。我們不知道為什么在本研究中沒有檢測(cè)到MyoD的表達(dá),一個(gè)可能的解釋就是由于rhEGF的存在影響了MyoD的表達(dá)。更重要的是在同等條件下,雖然MSCs也可被誘導(dǎo)為MHC和myogenin陽性的多核肌纖維,但ELSCs的成肌分化率顯著高于MSCs,表明ELSCs具有更強(qiáng)的成肌分化能力。ELSCs的成肌分化能力優(yōu)于MSCs的一個(gè)重要原因在于:無血清培養(yǎng)體系非常有利于骨髓中原始干細(xì)胞的增殖生長,最大程度地保持了多潛能干細(xì)胞的干性(stemness),即最大程度地保持了其原本就有的分化潛能。而來自于相同骨髓的MSCs,含血清的培養(yǎng)體系很容易促使多潛能干細(xì)胞的分化,很大程度上丟失了原始干細(xì)胞的干性。這個(gè)研究結(jié)果還提示:應(yīng)該進(jìn)一步思考什么樣的細(xì)胞才是骨髓中的真正干細(xì)胞。最近Bhartiya等[20]提出:成體組織中真正的干細(xì)胞是VSELs這樣的多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cells),MSCs和造血干細(xì)胞其實(shí)都是多潛能干細(xì)胞增殖分裂產(chǎn)生的祖干細(xì)胞(progenitor stem cells)。這里VSELs與本文中ELSCs本質(zhì)上屬于同一類細(xì)胞,只是命名不同罷了。他還認(rèn)為:過去眾多自體干細(xì)胞治療試驗(yàn)效果欠佳的重要原因就是移植的是祖干細(xì)胞,而不是具有最大再生潛能的多潛能干細(xì)胞。有的學(xué)者[12]更進(jìn)一步認(rèn)為MSCs更恰當(dāng)?shù)拿Q是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal stromal cells),因?yàn)槠渲饕饔貌皇窃偕?,而是其旁分泌機(jī)制發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)功能。盡管ELSCs與MSCs之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究,但本研究結(jié)果至少為肌營養(yǎng)不良癥等肌病的干細(xì)胞治療提供了種子細(xì)胞選擇的思路,為這些疾病的治療帶來了新的希望。

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